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EHD proteins in apicomplexan parasites

Kohlhepp, Florian

German Title: EHD-Proteine in Parasiten der Apicomplexa

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Abstract

A bottle neck in malaria research is the investigation of Plasmodium falciparum liver stage parasites because of technical issues in the infection of Anopheles mosquitoes with these parasites and subsequent generation of infectious sporozoites. Therefore I, in close collaboration with a colleague, established a combined in vitro/in vivo P. falciparum life-cycle in our lab. For that a protocol was established that included the generation of sexual P. falciparum stages in cell culture that were subsequently transmitted to Anopheles mosquitoes utilizing a special membrane feeding system. Later in the life-cycle sporozoites were extracted from the mosquito salivary glands to nally infect liver cells for further studies. We were able to establish a constant mosquito-infection rate for several months to perform experiments on P. falciparum sporozoites and exo-erythrocytic forms. To help decipher the in apicomplexans so far mostly uncharacterized cellular process endocytosis I investigated the function and localization of an EH-domain containing dynamin-like protein in Toxoplasma and Plasmodium. It belongs to a family of eukaryotic Eps15-homology domain containing proteins (EHDs) that have been characterized in higher eukaryotes and especially vertebrates to be part of endocytic events such as vesicular tracking and endocytic recycling. I was able to show by an in silico analysis that in contrast to vertebrates (four dierent EHDs) there is only one protein member of this familiy existing in each apicomplexan. Nevertheless, the apicomplexan EHD-protein has similar to all other EHD-proteins a predicted characteristic ATPase-domain (dynamin-like G-domain) and the Eps15-homology domain (EH). Through a uorescent tagging approach I was able to show a dynamic localization of the Toxoplasma EHD-protein member TgRME-1 (named after its ortholog in C. elegans receptor-mediated endocytosis protein 1) within the parasites. It localized to a vesicular compartment within the parasites that did not colocalize with known organelles so far. The compartment fragmented upon cellular division and is most likely involved in vesicular tracking of supply vesicles that transport lipids or other nutrients to the newly forming daughter-cells. From the data obtained in this thesis it can be hypothesized that the TgRME-1 labelled compartment represents a storage compartment that is filled up during the non-replicative phase and during endodyogeny helps to form daughter-cells. Structural analysis of the protein by deletion of either the G-domain or the EH-domain revealed a similar architecture of the protein compared to published data on mammalian EHDs. Investigation of the Plasmodium berghei EHD (PbEHD) with an antibody generated against the protein revealed a dfferent localization in different parasite stages. Whereas the protein localized to several vesicular compartments in the sporozoite stage it concentrated to a single organelle-like compartment in liver-stages 24 hours after invasion. This compartment later (48 hours after invasion) also fragmented and was distributed to the newly forming merozoites during schizogony, similar to TgRME-1. This subcellular localization indicated that both proteins might share a similar function in tachyzoites of Toxoplasma and Plasmodium liver stage parasites. A phenotypical analysis of PbEHD via generation of a pbehd (-) parasite revealed a putative function for the protein during intrahepatic development. The pbehd (-) liver stage parasite showed a reduced growth rate in vivo and in vitro but was still able to complete the life-cycle. In vivo, C57BL/6 mice infected with pbehd (-) parasites showed a prolonged prepatency period and did not develop experimental cerebral malaria in contrast to wildtype-infected mice. I was able to narrow down this protective effect solely to both the prolonged liver-stage phase and the involvement of the immunemodulator cytokine IL-10. Even though a defined role for the EHD-protein in the apicomplexan parasites could not be determined in this thesis I was able to characterize its architecure and localization in Toxoplasma gondii and Plasmodium berghei. I was able to identify a so far uncharacterized compartment in these parasites that is most likely involved in endocytic-recycling and storage of nutrients such as lipids for the parasites. In addition, my studies showed that the apicomplexan EHD-protein is involved in processes of the cellular division. A better understanding of these and other mechanisms of endocytosis will lead to anti-parasitic strategies that may reduce the burden caused by apicomplexan parasites.

Translation of abstract (German)

Eine kritische Engstelle der Forschung an Plasmodium falciparum ist die Untersuchung von Leberstadien aufgrund technischer Hindernisse bei der Infektion von Anopheles Stechmuecken und der anschliessenden Erzeugung von infektioesen Sporozoiten. Daher etablierte ich zusammen mit einem Kollegen einen kombinierten in vivo/in vitro P. falciparum-Lebenszyklus in unserem Labor. Im Rahmen dessen wurde ein Protokoll entwickelt, das die Erzeugung von P. falciparum-Sexualstadien und anschliessende Übertragung des Erregers auf Anopheles Stechmuecken beinhaltete. Im weiteren Verlauf des Lebenszykluses wurden Sporozoiten aus den Speicheldruesen der Stechmuecken extrahiert und anschliessend Leberzellen mit diesen infiziert. Es gelang uns, die Infektionsrate der Stechmücken über Monate hinweg konstant hoch zu halten, um Experimente an Sporozoiten und exo-erythrozytären Stadien von P. falciparum durchführen zu können. Um zur Entzifferung des in Apicomplexa bisher weitestgehend unbekannten Prozesses der Endozytose beizutragen, untersuchte ich die Funktion und Lokalisation eines EH-Domänen-beinhaltenden Dynamin-ähnlichen Proteins in Toxoplasma und Plas- modium. Dieses Protein gehört einer Familie von eukaryotischen Eps15-Homologie- Domänen beinhaltenden Proteinen (EHDs) an, denen in höheren Eukaryoten und speziell in Vertebraten eine Rolle bei vesikulären Transporten und endozytotischem Recycling zugesprochen werden konnte. Ich konnte mittels in silico-Analysen zeigen, dass im Unterschied zu Vertebraten (besitzen 4 EHD-Proteine) in Apicomplexa nur jeweils ein Protein dieser Familie vorhanden ist. Dennoch besitzt auch das EHD-Protein der Apicomplexa laut Prognosen von Datenbanken die charakteristische ATPase-Domäne (Dynamin-ähnliche G-Domäne) und die Eps15-Homologie (EH)-Domäne. Ich war in der Lage, mittels uoreszentem Tag eine dynamische Lokalisation des Toxoplasma EHD-proteins TgRME-1 (benannt nach seinem Ortholog in C. elegans: Receptor-mediated endocytosis protein 1) zu zeigen. Das Protein befand sich innerhalb eines vesikulären Kompartiments innerhalb des Parasiten, welches in seiner Lokalisierung nicht mit einem bisher bekannten Organell übereinstimmte. Während der Zellteilung teilte sich das Kompartiment und ist hierbei höchst wahrscheinlich beteiligt an der Verteilung von Vesikeln, die Lipide oder andere Nährstoffe zu den sich neu bildenden Tochterzellen bringen. Zusätzlich kann von den in dieser Arbeit erzeugten Daten abgeleitet werden, dass es sich bei dem TgRME-1-Kompartiment vermutlich um einen Speicher handelt, der während der Nicht-Teilungsphase aufgefüllt wird und während der Endodyogenese die Bildung der Tochterzellen unterstützt. Die strukurelle Analyse des Proteins ergab durch Deletion von entweder der G-Domäne oder der EH-Domäne eine mit den Säuger- EHD-Proteinen vergleichbare Architektur. Die Untersuchung des EHD-Proteins in Plasmodium berghei (PbEHD) mittels eines gegen das Protein erzeugten Antikörpers ergab eine unterschiedliche Lokalisation des Proteins in verschiedenen Stadien des Erregers. Während sich das Protein in Sporozoiten in mehreren vesikulären Kompartimenten befand, war es auch in Leberstadien 24 Stunden nach der Invasion in einem einzigen Organell-ähnlichen Kompartiment zu finden. Dieses Kompartiment teilte sich später (48 Stunden nach der Invasion) ebenfalls auf und verteilte sich während der Shizogonie auf die einzelnen Merozoiten, vergleichbar mit TgRME-1. Diese subzelluläre Lokalisation deutet darauf hin, dass beide Proteine eine ähnliche Funktion in Tachyzoiten von Toxoplasma und Leberstadien von Plasmodium ausführen. Eine phänotypische Analyse von PbEHD mittels Erzeugung eines pbehd (-)-Parasiten ergab eine mögliche Funktion des Proteins während der Leberstadienentwicklung. Die pbehd (-)-Leberstadien wuchsen langsamer in vivo und in vitro, waren aber immer noch in der Lage, den Lebenzyklus zu vervollständigen. In vivo zeigte sich in infizierten C57BL/6 Mäusen im Gegensatz zu mit Wildtyp infizierten Mäusen eine verlängerte Präpatenz und ein Schutz vor der Entstehung von experimenteller cerebraler Malaria (ECM). Ich war in der Lage zu zeigen, dass dieser schützende Effekt einzig der verlängerten Leberstadienphase und der Beteiligung des Zytokins IL-10 zuzuschreiben ist. Obwohl dem EHD-Protein in Apicomplexa in dieser Arbeit keine definierte Funktion zugeordnet werden konnte, war ich dennoch in der Lage die Architektur und Lokalisation des Proteins in Toxoplasma gondii und Plasmodium berghei zu charakterisieren. Ich konnte ein bisher nicht charakterisiertes Kompartiment in diesen Parasiten identifizieren, das höchst wahrscheinlich an endozytotischem Recycling und Speicher von Nährstoffen wie beispielsweise Lipiden beteiligt ist. Zusätzlich zeigten meine Untersuchungen, dass das Apicomplexa EHD-Protein beteiligt ist an der Zellteilung der Parasiten. Ein besseres Verständnis von diesen und anderen Mechanismen der Endozytose wird dazu beitragen, anti-parasitische Strategien zu entwickeln, die die von Apicomplexa Parasiten verursachte Belastung vermindern können.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Lanzer, Prof. Dr. Michael
Date of thesis defense: 21 December 2012
Date Deposited: 16 Jan 2013 10:39
Date: 2012
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
610 Medical sciences Medicine
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