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Mechanochemistry of Disulfide Bonds in Proteins

Baldus, Ilona Beatrice

German Title: Mechanochemie von Disulfidbrücken in Proteinen

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Abstract

Mechanical force alters a protein's stability not only due to its ability to unfold the biomolecule. As soon as a disulfide bond cross-linking the protein is exposed to force, its reduction rate is altered. Our first aim was quantifying the direct effect of force onto the chemical reactivity of sulphur-sulphur bonds in contrast to indirect, e.g. steric or mechanistic, influences. To this end, we evaluated the dependency of a disulfide bond's redox potential on a pulling force applied along the system. Our hybrid quantum and molecular mechanics simulations of cystine as a model system take conformational dynamics and explicit solvation into account and show that redox potentials increase over the whole range of forces probed here (30 - 3320 pN), and thus even in the absence of a significant disulfide bond elongation(<500 pN). Instead, at low forces, dihedrals and angles as the softer degrees of freedom are stretched and contribute to the destabilization of the oxidized state. We find physiological forces to be likely to tune the disulfide's redox potentials to an extent similar to the tuning within proteins by point mutations. Next, we asked how internal strain resulting from the protein structure tunes redox potentials using free energy calculations, more precisely nonequilibrium Molecular Mechanics transformations and the Crooks Gaussian Intersection method. We added a residue to the Charmm force field that models a disulfide bond in the reference state and that can be transformed into a thiol in the product state. To our knowledge, this is the first approach to open a covalent bond by means of free energy transformation. We tested our method on E. coli and S. aureus thioredoxin, and could partly reproduce relative redox potentials of the wild-type and some mutants. We discuss promising routes to improve the accuracy of these challenging calculations. Finally, we investigated the impact on force-induced unfolding by a special type of disulfide bond, a vicinal disulfide that links two adjacent cysteines. Our model system here is the von Willebrand factor (vWF) A2 domain. We observe similar stabilities in equilibrium for both the native system and its analogue with the disulfide bond broken and also similar collective motions. Application of an external force, however, induces a difference: Unfolding of the vWF A2 domain with the vicinal disulfide bond present leads to higher rupture forces than when it is missing. This indicates that the vicinal disulfide bond prevents the domain from unintentional unfolding.

Translation of abstract (German)

Mechanische Kraft kann ein Protein destabilisieren und entfalten. Kraft hat außerdem einen direkten Einfluss auf einzelne chemische Bindungen im Protein. Wird eine Disulfidbrücke, die eine Quervernetzung des Biomoleküls darstellt, einer Kraft ausgesetzt, verändert sich ihre Reduktionsrate. Unser erstes Ziel bestand darin, den direkten Effekt von Kraft auf die chemische Reaktivität der Schwefel-Schwefel-Bindung zu quantifizieren und ihn somit von indirekter Krafteinwirkung, wie sie durch Sterik und Mechanik des Proteins entsteht, abzusetzen. Wir haben untersucht, wie das Redoxpotentials einer Disulfidbindung in unserem Testsystem durch Zugkraft verändert wird. Hybride quantum- und klassische mechanische Simulationen von unserem Modellsystem Cystin berücksichtigen Konformationsdynamik in einem expliziten Lösungsmittel. Wir konnten zeigen, dass Redoxpotentiale über den gesamten untersuchten Kraftbereich (30 - 3320 pN) ansteigen. Dieser Energieanstieg konnte bereits in einem Kraftbereich beobachtet werden, in dem die Länge der Disulfidbindung von der Kraft unberührt bleibt (<500 pN). Stattdessen werden unter diesen kleinen Kräften Dihedrale und Winkel, also die weichen Freiheitsgrade, gedehnt und tragen so zur Destabilisierung des oxidierten Zustands bei. Kräfte, die unter physiologischen Bedingungen auftreten, haben also das Potential, das Redoxpotential einer Disulfidbindung um einen ähnlichen Betrag zu verändern wie Punktmutationen in Proteinen. Als nächstes gingen wir der Frage nach, wie interne Spannung innerhalb eines Proteins Redoxpotentiale verändert. Hierzu bedienten wir uns der Methode der Freien Energie-Rechnungen, im Speziellen der nicht-Equilibrium Molekülmechanik-Transformationen und der Crooks Gaussian Intersection Methode. Wir erweiterten das Charmm Kraftfeld um ein Residuum, das die Disulfidbindung im Referenzsystem modelliert und in zwei Thiole umgewandelt werden kann, um das Zielsystem darzustellen. Nach unserem Wissen ist dies der erste Ansatz, eine kovalente Bindung im Kontext einer Freien Energie Umwandlung zu öffnen. Wir nutzten E. coli und S. aureus Thioredoxin als Testsysteme für unsere Methode. Relative Redoxpotentiale der Wildtypen und einiger Mutationen konnten zum Teil reproduziert werden. Wir diskutieren vielversprechende Möglichkeiten, wie die herausfordernden Rechnungen verbessert werden könnten. Am Ende der Arbeit untersuchen wir den Einfluss von kraftgestützter Entfaltung einer speziellen Disulfidbindung, der vicinalen Disulfidbindung, die zwei benachbarte Cysteine verbrückt. Als Modellsystem diente uns hier die A2 Domäne des von Willebrand Faktors (vWF). Wir verglichen die Domäne unter nativen Bedingungen mit einer Domäne ohne Schwefel-Schwefel-Brücke. Beide zeigen ähnliche Stabilitäten sowie ähnliche kollektive Bewegung ihrer Hauptkomponenten. Ein Unterschied besteht jedoch unter Krafteinwirkung: Öffnen der Disulfidbindung senkt die Kraft die zur Entfaltung und zum Abreißen der alpha-Helix, in welche die vicinale Disulfidbindung eingebettet ist, aufgebracht werden muss. Dies deutet darauf hin, dass die vicinale Disulfidbindung die Domäne vor ungewollter Entfaltung schützt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Comba, Prof. Dr. Peter
Place of Publication: Anorganisch-Chemisches Institut, Universität Heidelberg
Date of thesis defense: 25 January 2013
Date Deposited: 07 Feb 2013 06:51
Date: 2013
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Inorganic Chemistry
Subjects: 004 Data processing Computer science
500 Natural sciences and mathematics
540 Chemistry and allied sciences
570 Life sciences
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