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Die transkriptionelle und epigenetische Regulation des humanen L1CAM Gens im Endometriumkarzinom

Schirmer, Uwe

English Title: The transcriptional and epigenetic regulation of the human L1CAM gene in endometrial carcinoma

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Abstract

Das Endometriumkarzinom (EK) ist in den Industrieländern die häufi gste diagnostizierte invasive Tumorerkrankung des weiblichen Urogenitaltrakts. Bei der Klassifi zierung wird zwischen dem meist mit einem positiven Verlauf assoziierten Typ-I EK und dem aggressiven Typ-II EK unterschieden. Ergebnisse der letzten Jahre zeigen, dass dem Zelladhäsionsmolekül L1CAM, welches von gesundem Endometrium nicht exprimiert wird, eine entscheidende Rolle in der Tumorprogression zukommt. L1CAM wird dabei hauptsächlich bei hochgradigen Typ-II EKs, die als seröse und klarzellige Adenokarzinome eingestuft werden, detektiert. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Überexpression des L1CAM-Gens die Motilität der Tumorzellen sowie das Tumorwachstums fördert. Dabei ist ein charakteristisches Merkmal, dass die L1CAM-Genexpression oft mit der invasiven Front eines Tumors assoziiert ist. Es wird beschrieben, dass Zellen in der invasiven Front eine Epitheliale-Mesenchymale-Transition (EMT) durchlaufen und anschließend in das umgebende Gewebe invadieren. Dieser Prozess wird durch die L1CAM-Überexpression unterstützt. Derzeit ist immer noch unklar, wie es zu dieser atypischen L1CAM-Expression an der invasiven Tumorfront kommt. Die zentrale Frage der vorliegenden Arbeit war daher, welchen Regulationsmechanismen das L1CAM-Gen im endometrialen Tumorgewebe unterliegt. Um dies zu klären, wurde die transkriptionelle Regulation von L1CAM auf unterschiedlichen Ebenen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die TGF-β1 induzierte EMT in EK-Zellen zu einer Aktivierung von L1CAM führt die durch den EMT assoziierten Transkriptionsfaktor Slug vermittelt wird. Die durchgeführten DNA-Bindungsanalysen bestätigen eine direkte Interaktion des Transkriptionsfaktors Slug mit den zwei alternativen Promotoren des L1CAMGens. Des Weiteren sind Slug und L1CAM auf mRNA-Ebene in EK-Zelllinien positiv miteinander korreliert. Neben dem EMT-Aktivator Slug konnte mit dem Repressor REST ein weiterer Regulator von L1CAM identifi ziert werden. Der Einfl uss von REST auf die L1CAM-Expression war zuvor bereits in neuronalen Zellen beschrieben worden. Der direkte Mechanismus, über den REST in die L1CAM-Expression eingreift, bleibt zu klären. Über der Ebene der transkriptionellen Regulation hinaus, konnte gezeigt werden, dass auch der epigenetischen Regulation eine bedeutende Rolle in der Kontrolle der L1CAM-Expression zukommt. So konnte nachgewiesen werden, dass sowohl ein Einfl uss der Histon-Deacetylierung als auch der DNA-Methylierung bei der Suppression des L1CAM-Gens vorliegt. Dementsprechend führte die Behandlung von EK-Zelllinien mit Inhibitoren der Histon-Deacetylasen und/oder DNA-Methyltransferasen (DNMTs) zu einer Aktivierung des L1CAM-Gens. Darüber hinaus konnte mittels einer Methylierunganalyse nachgewiesen werden, dass in EK-Zelllinien der Grad der Promoter-Hypomethylierung mit der L1CAM-Expression korreliert. Entgegen der Erwartungen führte die Behandlung von L1CAM exprimierenden Zelllinien mit DNMTInhibitoren, zu einer drastischen Abnahme der L1CAM-Expression. Die nachfolgende Analysen dieses Effekts offenbarten eine Aktivierung von microRNAs, insbesondere der miR-34a, welche sehr wahrscheinlich zu der post-transkriptionellen Regulation von L1CAM beiträgt. Zusammenfassend belegen die Daten dieser Arbeit eine komplexe Kontrolle des L1CAM-Gens auf mehreren Ebenen. So greifen sowohl epigenetische als auch transkriptionelle und post-transkriptionelle Mechanismen in die Expression von L1CAM ein. Eine Deregulation dieser komplexen Repression kann so zu einer fokalen Aktivierung von L1CAM in hochgradigen EKs führen.

Translation of abstract (English)

The endometrial carcinoma (EC) is the most frequent gynecological malignancy in the western world. Tumors of that entity are classifi ed into two subtypes, the less aggressive type-I-EC, which is correlated with a good prognosis, and a highly differentiated and more aggressive type-II-EC. Recent studies demonstrated that the L1CAM molecule, which is normally not expressed in the endometrial tissue, plays a central role in the progression of the EC. Aberrant L1CAM expression is exclusively detectable in high grade type-II endometrial carcinomas, namely the serous and clear cell phenotypes. The abnormal L1CAM expression is correlated with a poor prognosis, not only in endometrial carcinomas but also in a variety of other tumor entities. It has been shown that the expression of L1CAM increases tumor cell motility and invasion, as well as tumor growth. Furthermore it could be shown that in some human carcinomas the L1CAM expression is restricted to the invasive front of the tumor. There is evidence that cells at the invasive front undergo an epithelial mesenchymal transition (EMT). These cells benefi t from L1CAM-mediated cell motility when leaving the solid tumor and forming metastasis elsewhere in the body. Despite the extensive work on L1CAM expression in human tumors the mechanism, which drives the L1CAM upregulation still remains to be unravelled. Along this line, the central aim of this thesis was to identify the mechanisms contributing to the regulation of L1CAM expression in endometrial carcinomas. To address this question we investigated the transcriptional regulation of L1CAM on different levels. First we could show that a TGF-β1 induced EMT leads to increased L1CAM expression in EC cell lines and this process depends on the transcription factor slug. DNA binding studies revealed a direct interaction of slug with both L1CAM promoter sites. Furthermore a positive correlation between slug and L1CAM levels could be shown in different EC cell lines. Beside the activator slug the repressor REST was identifi ed to contribute to the L1CAM regulation. The regulatory role of REST was described in neuronal cells before and has now been confi rmed in EC cell lines as well. However, it is still unclear which mechanism underlies the strict repression of the L1CAM-gene by REST in the EC cell lines. Two epigenetic mechanisms contributing to the regulation of L1CAM expression, DNA-methylation and histone deacetylation, could be identifi ed. Both mechanisms suppress L1CAM and according to this, inhibition of histone deacetylases and DNA methyl transferases (DNMTs) lead to strongly increased L1CAMexpression in EC cell lines. Furthermore it was shown that L1CAM promoter hypomethylation and L1CAM expression are positively correlated in EC cell lines. Surprisingly, the treatment of L1CAM positive cell lines with DNMT inhibitors leads to a strong decrease of the L1CAM-mRNA as well as protein level. It might be possible that a deregulation of microRNAs, especially the miR-34a, contribute to the post transcriptional regulation of L1CAM. A reporter assay revealed that miR-34a binds to the L1CAM 3’-UTR and thereby blocks the translation. In summary, these data suggest a complex regulation of L1CAM on different levels. Epigenetic effects as well as transcriptional and post transcriptional mechanisms keep the L1CAM gene under control in normal cells, but a tumor-driven deregulation enhances aberrant L1CAM expression in high grade carcinomas.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Altevogt, Prof. Dr. Hans Peter
Date of thesis defense: 16 January 2013
Date Deposited: 09 Apr 2013 12:20
Date: 2013
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords: Epigenetik, transkriptionelle Regulation, L1CAM, Endometriumkarzinom, Transkriptionsfaktoren, REST, Slug
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