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Einzelmolekül-spektroskopische Methoden zur Untersuchung von Dynamiken des STAT5b-Proteins in lebenden Maus Fibroblasten

Barzan, Daniel

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PDF, German
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Abstract

Das Zusammenspiel der verschiedenen Organe in einem komplexen System wie dem menschlichen Körper erfordert fein aufeinander abgestimmte Steuer- und Kontrollmechanismen. Der JAK/STAT Signalweg ist einer der direktesten Informations-Übertragungswege von extrazellulären Botenstoffen, die das Signal über die Zellmembran in das Zytosol bis in den Zellkern zu den jeweiligen Zielgenen weiterleiten. Der Wachstumsfaktor Epo spielt unter anderem in der Erythropoese in Zusammenhang mit dem EpoR und dem Signalprotein STAT5b eine wesentliche Rolle. In dieser Arbeit wird das STAT5b-Protein in lebenden NIH3T3 Maus Fibroblasten hinsichtlich seiner Diffusion im Zytosol und im Zellkern und bezüglich der Bindungseigenschaften an seinen aktivierenden Rezeptor (EpoR) untersucht. Die Experimente werden mit den Einzelmolekül-spektroskopischen Methoden FCS und „VA-TIRF“ durchgeführt. Hierfür muss zunächst eine geeignete Farbstoffmarkierung des STAT5b gefunden werden. Die Verwendung eines Fusionsproteins aus STAT5b und fluoreszierendem mCherry bietet eine spezifische und stöchiometrische Markierung. Allerdings zeigt mCherry in den Versuchen eine ausgeprägte Fluktuation in seiner Emission, das so genannte „Blinken“, und eine geringe Photostabilität. Damit ist das Fluoreszenzprotein für FCS-Messungen nur bedingt geeignet. Für DIFIM, eine Methode die durch punktweise FCS-Analysen ein Raster von relativen Diffusionszeiten eines Ausschnitts einer Zelle anfertigt, ist STAT5b-mCherry ungeeignet. Um die Untersuchungen der Diffusion und Bindung des STAT5b dennoch erfolgreich durchzuführen wird es mit dem SNAP-Tag-Protein fusioniert, welches dann mit dem organischen Farbstoff TMR-Star stöchiometrisch markiert wird. In dieser Arbeit konnte ein Markierungsprotokoll etabliert werden, welches sicherstellt, dass die Markierung spezifisch und das Signalübertragungsprotein funktional ist. Die FCS-Messungen im Zytosol und Zellkern ergeben für unterschiedlich behandelte Zellen verschiedene Diffusionskoeffizienten (D). Für unbehandelte und gehungerte Zellen sind die mittleren D im Zytosol schneller als im Zellkern. Nach der Aktivierung des Signalwegs mit Epo kehrt sich das Verhältnis um und der mittlere D im Zellkern nimmt zu. Wahrscheinlich führt die Dimerisierung des aktivierten Proteins zu einer Verringerung, während die Bindung des aktivierten STAT5b-Dimers an die DNA im Zellkern vermutlich zu der Erhöhung des D führt. Die Messungen mit „VA-TIRF“ zeigen für die Bindung des Proteins an der Zellmembran keine einheitliche Bindungszeit und auch keinen Unterschied hinsichtlich Epo-stimulierten und -unstimulierten Zellen. Daher kann davon ausgegangen werden, dass unspezifische Wechselwirkungen des STAT5b mit der Zellmembran und anderen Rezeptoren in der Zellmembran der Bindung mit dem EpoR überlagert sind. Bei der Analyse der gesamten Aktivität des Proteins an der Zellmembran zu verschiedenen Zeitpunkten nach Epo-Stimulierung ergibt sich ein Aktivitätsmaximum bei 7,5 min. In den Bindungs-An-Zeiten des STAT5b ist hingegen kein Unterschied zu erkennen. Die gesteigerte STAT5b-Aktivität ließe sich durch verkürzte Bindungs-Aus-Zeiten des Proteins zum EpoR oder durch eine erhöhte Anzahl der Rezeptoren in der Zellmembran infolge der Epo-Stimulierung erklären. In Übereinstimmung zeigen Untersuchungen der Phosphorylierung von STAT5b durch V. Becker et. al. die maximale Phosphorylierung bei 7.5 min durch eine erhöhte Rekrutierung von EpoR aus dem zytosolischen Pool an die Zellmembran. Videoaufnahmen mittels „Variable-Angle-TIRF“ mit Belichtungszeiten von nur 5 ms pro Einzelbild zeigten, dass es möglich ist über ImTIR-FCS-Analysen Diffusionskoeffizienten des STAT5b zu erhalten. Die Wechselwirkung mit der Zellmembran wird durch die langsame Diffusion des Proteins widergespiegelt, die mit 1,4 – 2,4 µm2/s zwischen der von zytosolischen und Transmembran -Proteinen liegt. Die ermittelten Diffusionskoeffizienten und der Verlauf der STAT5b-Aktivität können im Weiteren in Modelle für den JAK/STAT Signalweg eingefügt werden und so den Ablauf der Aktivierung in diesem System verdeutlichen. Diese Arbeit leistet somit einen Beitrag zum tieferen Einblick in die Signalweiterleitung.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Herten, PD Dr. Dirk-Peter
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 8 March 2013
Date Deposited: 26 Mar 2013 07:13
Date: 2013
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
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