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Abstract

Seit mehr als 40 Jahren werden in der Literatur kontroverse Mechanismen diskutiert, welche die Reepithelialisierung und die damit einhergehende Bildung einer epidermalen Migrationszunge postulieren. Die diskutierten Mechanismen lassen hierbei die kollektive Zellmigration als möglichen Einflussfaktor während der Reepithelialisierung vollkommen außer Acht. Die, im Rahmen dieser Arbeit, etablierten organotypischen Wundheilungsmodelle ermöglichten die Analyse der Reepithelialisierung aus einer systembiologischen Perspektive und führten zu einem neuen Reepithelialisierungmechanismus, der Proliferation sowie kollektive Zellmigration als essentielle Faktoren in sich vereint. Die Proliferationsanalyse zeigte hierbei, dass sich die proliferative Aktivität als konzentrische Welle von den unverwundeten Bereichen in Richtung des Wundareals bewegt, wobei die Majorität der neu produzierten Zellen nicht von der Wunde selbst, sondern auf Basis dieser Proliferationswelle generiert wird. Darüber hinaus konnte durch Polaritätsanalyse gezeigt werden, dass diese neu generierten Zellen mittels kollektiver Migration in das Wundareal einwanderten um die Migrationszunge zu verlängern. Hierbei migrierten basale Keratinozyten des umliegenden, unverwundeten Gewebes sowie in der Migrationszunge selbst unter den differenzierten, suprabasalen Keratinozyten hindurch. Eine neu entwickelte doppelte Fluoreszenzfärbestrategie ermöglichte es, die räumliche Verteilung migrierender Keratinozyten innerhalb der sich bildenden Migrationszunge zu verfolgen. Hierbei zeigte sich, dass im Laufe der Reepithelialisierung alle fluoreszenzgefärbten Zellen im suprabasalen Kompartiment der Migrationszunge akkumulierten um einen sich kontinuierlich verlängernden Schutzschild zu bilden, welcher durch die kollektive Migration basaler Keratinozyten vorangetrieben wird. Zusammenfassend basiert dieser Reepithelialisierungsmechanismus zur Verlängerung der EET auf drei Prozessen: (i) Der kollektiven Migration basaler Keratinozyten, (ii) dem Lifting Mechanismus, welcher für die Ausbildung eines mehrschichtigen Epithels sorgt, sowie (iii) der aktiven Migration der Keratinozyten an der Migrationsfront der EET. Der im Rahmen dieser Arbeit postulierte Reepithelialisierungsmechanismus stellt somit die in der Literatur diskutierten Mechanismen in Frage und führt zu einem fortschrittlichen Erklärungsmodell der Reepithelialisierung epidermaler Wunden. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit mittels Multiplex Technologie Wundheilungassoziierte Signalwege untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein zweites, neuartiges Wundheilungsmodell auf Basis epidermaler, dermaler Kokulturen entwickelt. Dieses Modell erlaubte die Interaktion zwischen Keratinozyten und Fibroblasten während der Kultivierung, ermöglichte jedoch durch einfache Separation beider Zelltypen eine voneinander unabhängige proteomische Analyse. Auf Basis dieser Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass die mitogen aktivierten Proteinkinasen p38 und Erk1/2 sowie der Transkriptionsfaktor STAT3 eine entscheidende Rolle während der Reepithelialisierung spielen. Zeigten Erk1/2 und STAT3 eine durch Fibroblasten induzierbare Aktivität, so konnte die Phosphorylierung von p38 auf den Wundstimulus zurückgeführt werden. Überdies wiesen p38 und STAT3 Migrations-assoziierte Effekte auf, während die Phosphorylierung von Erk1/2 zu einer möglichen Steigerung proliferativer Aktivität der Keratinozyten führte. Die Analyse des Kulturüberstandes ermöglichte es weiterhin Zytokine zu identifizieren, welche potentiell für die Aktivierung der jeweiligen Signalwege verantwortlich sein könnten. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Dissertation organotypische in vitro Wundheilungsmodelle etabliert, welche die Analyse der Reepithelialisierung, als auch Wundheilung-assoziierter Signalwege ermöglichten. Auf Basis dieser Ergebnisse konnte ein neuartiger Reepithelialisierungsmechanismus postuliert werden, der Proliferation, Differenzierung und kollektive Zellmigration in sich vereint und entscheidend zu dem Verständnis der Reepithelialisierung während der Wundheilung beträgt. Zusätzlich konnten durch die Anwendung der Multiplex-Technologie mit p38, Erk1/2, sowie STAT3 essentielle Signalwege identifiziert werden, deren zukünftige Pertubation wichtige Werkzeuge zur Modulation der Wundheilung darstellen.

Translation of abstract (English)

For more than four decades controversial concepts were proposed to understand how a three dimensional neoepidermis formed in a healing skin wound. Especially, the role and function of collective cell migration in wound healing remained unclear. Within this study organotypic tissue cultures have been established. Based on reepithelialization analysis of these cultures a conceptual model showing how proliferation and collective migration are integrated by a novel “extending shield mechanism” (ESM) was developed. The analysis showed that keratinocyte proliferation occurs in a concentric, traveling wave which is spatially lacking behind the extending epidermal tongue. The overwhelming amount of novel cells are thereby produced not by the wound itself, but by this wave. Comprehensively quantifying cell polarization showed that the newly produced cells collectively migrated from this wave towards the step-wise extending wound edge. Inside the surrounding tissue as well as in the extending tongue, cell movement occured in the basal layer underneath a fixed suprabasal layer. Using fluorescent time-lag staining (CMFDA, CMTPX) it was possible to track the spatial destination of those migrating cells. Thereby it was discovered that all stained cells became distributed on top of the extending epidermal tongue in form of an extending shield. Shield extension thereby appeared driven by massive collective cell migration from unwounded tissue regions. Therefore the developed migration mechanism render the previously in literature discussed models inconsistent and lead to the first model capable of explaining re-epithelialization of epidermal wounds. Furthermore wound healing associated signaling pathways were analyzed using a multiplex phosphoproteomic approach. For this reason an organotypic wound model based on keratinocyte fibroblast coculture was established. This model allowed keratinocyte-fibroblast interactions on the on hand, but on the other hand enabled independent proteomic analysis of both cell types. Based on these studies mitogen activated protein kinases p38 and Erk1/2 and transcription factor STAT3 have been found to play a major role during reepithelialization. While Erk1/2 and STAT3 showed a fibroblast inducible activity, the phosphorylation of p38 was dependent on the wound stimulus. Besides p38 and STAT3 showed migration associated effects while Erk1/2 was found to possibly enhance the proliferative activity of the keratinocytes. By analyzing the culture supernatant it was possible to identify growth factors potentially triggering the particular pathways. In summary, this doctoral thesis shows that an three dimensional environment, which can only be provided by using organotypic cultures, is essential for analyzing keratinocyte migration and can be used to unravel novel migration mechanisms. Moreover the physiological conditions were shown to enable keratinocyte-fibroblast interaction therefore providing an outstanding system for studying wound healing associated pathways.