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Molecular Characterization of mutated Histone H3.3 in childhood Glioblastoma

Bender, Sebastian

German Title: Molekulare Charakterisierung von mutiertem Histon H3.3 in pädiatrischen Glioblastomen

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Abstract

In recent years, affordable costs of next-generation sequencing technologies set the basis for the characterization of a multitude of cancer genomes. In doing so, scientists all over the world reconfirmed that cancer is a disease of the (epi)genome. The growing number of genetic abnormalities found in chromatin remodeling factors in various cancer entities produced evidence that aberrant chromatin modification plays an essential role in cancer initiation and progression. Besides numerous mutations of histone modifying factors in different cancer types, two recurrent mutations within the histone H3.3 coding gene H3F3A have been identified in about 50% of pediatric glioblastoma. Both mutations result in amino acid substitutions at two critical residues of the histone tail of H3.3 (K27M or G34R/V). Since glioblastomas harboring one of these H3.3 mutations are characterized by a complex but stereotypic pattern of genetic and epigenetic alterations, the project presented here uses a variety of molecular techniques to study the functional mechanisms associated with both H3.3 mutations. By using confocal imaging of fluorescently labeled H3.3 mutants and genome-wide sequencing-based chromatin immunoprecipitation (ChIP-Seq) of ectopically expressed H3.3 mutants, it was demonstrated that deposition and incorporation of histone H3.3 into chromatin is not affected by the mutations. Furthermore, experiments with different cell lines, which were genetically modified to stably overexpress mutant H3.3, provide evidence that (at least) some of the genome-wide changes that were originally found in H3.3 mutated glioblastomas, can be faithfully recapitulated in vitro. The investigation of several epigenetic marks by Western blot analysis and immunohistochemistry identified a strong dominant negative effect of the K27M mutant H3.3 protein, which causes global reduction of the key epigenetic mark H3K27me3. Moreover, this epigenetic alteration found in primary tumors, was induced in vitro by overexpression of K27M mutant H3.3 in different cell lines. By using mass spectrometry to dissect the pattern of posttranslational modifications (PTM) at the histone tail of G34R mutant H3.3, a new PTM has been identified, namely dimethylation of arginine 34. Furthermore, first evidence is provided that this new PTM is causative for the downregulation of K36 trimethylation at G34R mutant H3.3. Finally, overexpression of mutant H3.3 in the brain of neonatal mice was performed by retroviral gene transfer. In doing so, this study aims at the elucidation of the in vivo tumorigenic potential of both histone H3.3 mutations alone or in combination with impaired TP53 function. In summary, the findings of this thesis provide novel insights into the comprehensive epigenetic changes caused by mutant histone H3.3 in pediatric GBMs. These results might provide the basis for the development of novel therapeutic strategies targeting the epigenetic changes induced by H3.3 mutations, which have been identified recently in nearly half of the tumors in children suffering from this devastating brain tumor.

Translation of abstract (German)

In den vergangenen Jahren bildeten die fallenden Kosten für die Hochdurchsatzsequenzierung die Grundlage für die genetische Analyse einer Vielzahl von Tumorgenomen. Hierdurch konnten Forscher weltweit bestätigen, dass es sich bei Krebs um eine Erkrankung des (Epi)Genoms handelt. In unterschiedlichen Krebsarten wurden vermehrt genetische Defekte in Chromatin-modifizierenden Faktoren gefunden, die den Beweis erbrachten, dass Veränderungen der Chromatinmodifizierung eine entscheidende Rolle bei der Krebsentstehung und beim Fortschreiten der Erkrankung spielen. Neben der Identifizierung einer Vielzahl von Mutationen in Histon-modifizierenden Faktoren in unterschiedlichen Krebsentitäten, wurden in pädiatrischen Glioblastomen (pedGBMs) zwei rekurrente Mutationen im Histon H3.3 kodierenden Gen H3F3A entdeckt. Beide Mutationen führen zum Austausch von Aminosäuren an wichtigen Positionen des Histonproteins (K27M bzw. G34R/V). Glioblastome, die eine dieser Mutationen tragen, zeichnen sich durch ein komplexes aber sehr charakteristisches Muster an genetischen und epigenetischen Veränderungen aus. Um beide H3.3 Mutationen funktionell zu charakterisieren, wurde eine Vielzahl von molekularen Untersuchungsmethoden verwendet. Unter Verwendung konfokaler Mikroskopie Flurochrom-gekoppelter H3.3 Mutanten und Genom-weiten Sequenzierdaten einer Chromatin Immunopräzipitation (ChIP-Seq) belegt diese Arbeit, dass die Inkorporation von Histon H3.3 in Chromatin durch keine der beiden Mutationen beeinträchtigt wird. In in vitro Experimenten wurden unterschiedlichen Zelllinien genetisch manipuliert, sodass sie mutiertes H3.3 überexprimieren. Die Ergebnisse zeigen, dass (zumindest) ein Teil der Genom-weiten Veränderungen, wie sie ursprünglich in H3.3 mutierten Glioblastomen gefunden wurden, im Zellkulturmodell rekapituliert werden. Die Untersuchung mehrerer epigenetischer Modifikationen durch Western Blot Analysen und Immunohistochemie identifizierte einen starken dominant-negativen Effekt des K27M mutierten H3.3 Proteins, welcher zu einer globalen Reduktion der H3K27me3 Expression führt. Diese epigenetische Veränderung in Primärtumoren konnte durch die Überexpression von K27M mutiertem H3.3 in mehreren Zelllinien in vitro nachgebildet werden. Massenspektrometrie wurde verwendet um posttranslationale Modifikationen (PTMs) am G34R mutierten Histon zu untersuchen. Das dadurch detektierte Dimethyl-Arginin 34 stellt eine bisher nicht beschriebene PTM dar. Darüber hinaus liefert diese Arbeit erste Hinweise dafür, dass diese neuartige PTM die H3K36 Trimethylierung an G34R mutiertem H3.3 negativ reguliert. Überdies wurden die Histon H3.3 Mutanten im Gehirn von neugeborenen Mäusen mittels retroviralen Gentransfers überexprimiert, um zu untersuchen, ob dies alleine oder in Kombination mit defektem TP53 Tumore induziert. Zusammenfassend gibt die vorliegende Arbeit neue Einblicke in die umfassenden epigenetischen Veränderungen, die durch H3.3 Mutationen in pädiatrischen GBMs hervorgerufen werden. Diese richtungsweisenden Ergebnisse könnten den ersten Schritt in der Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung der durch H3.3 Mutationen verursachten epigenetischen Veränderungen bedeuten. Diese wurden kürzlich in nahezu der Hälfte aller Tumore in Kinder und Jugendlichen beschrieben, die an diesem in der Regel tödlich verlaufenden Hirntumor leiden.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Buselmaier, Prof. Dr. Werner
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 10 April 2013
Date Deposited: 30 Apr 2013 11:26
Date: 1 October 2013
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
610 Medical sciences Medicine
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