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Systematic analysis of TGF-β/Smad signaling and (loss of) cytostatic outcome in human hepatocellular carcinoma cell lines

Dzieran, Johanna

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Abstract

Primary liver cancer, of which hepatocellular carcinomas (HCCs) accounts for 90 %, is the fifth most common and third deadliest cancer worldwide. As HCCs are strongly heterogenic and with symptoms occurring late, the development of efficient treatment strategies is until now challenging. Transforming growth factor beta (TGF-β) is a multifactorial cytokine and a driver of chronic liver disease progression, which eventually ends in HCC. TGF-β, which acts as a tumor suppressor during cancer development, may switch to tumor-supporting characteristics during cancer progression. The ambiguous nature of TGF-β, together with the strong heterogeneity of HCC, leads to a highly complex situation in regard to TGF-β signaling during hepatocarcinogenesis. As TGF-β signaling is frequently altered in HCC, it is an interesting target to develop new therapeutic strategies. However, this requires deep knowledge about the time point and underlying mechanisms of the switch in TGF-β signaling.

This question was addressed by a systematic in-depth analysis of cytostatic effects of TGF-β and mechanisms of resistance in ten commonly used liver cancer cell lines. TGF-β induced cell death or growth arrest in one group of cell lines (PLC/PRF/5, Hep3B, HuH7 and HepG2) in a Smad3 dependent manner. These cells commonly expressed relatively low basal levels of TGF-β1 and its inhibitor Smad7, but elevated levels of TβRII (TGF-β receptor II). Furthermore, they exhibited a high inducibility of Smad3 and TβRI expression, Smad3 transcriptional activity and target gene expression, as exemplified for Bim, PAI-1 and Smad7. Interestingly, all cell lines have previously been described to express an early TGF-β-response gene signature, which was also identified in HCC patients and correlates with a better prognosis. In contrast, the second group (HLE, HLF, FLC-4 and to some extent HuH6 cells) was resistant against cytostatic effects of TGF β and further characterized by high Smad7 and TGF-β1, low TβRII expression and low TGF-β induced Smad3 transcriptional activity. In addition, all but HuH6 cells had a highly motile phenotype. HCC-M and HCC-T cells shared characteristics of both groups, showing, e.g., resistance against TGF-β induced cytostasis but low TGF-β1, Smad7 and TβRII levels. Finally, analysis of patient samples showed an overexpression of Smad7 in 59 % of HCCs with a significant correlation to tumor size in a HBV related subgroup from China.

In conclusion, HCC cell lines can be allocated into two main groups regarding the cytostatic TGF-β response, which is accompanied by distinct differences in basal and TGF-β induced expression patterns of TGF-β signaling components and target genes. Smad7 upregulation seems to be an important mechanism in transformed hepatocytes to establish insensitivity against TGF-β induced cytostasis, and once this is accomplished, a more malignant phenotype may develop.

Translation of abstract (German)

Primärer Leberkrebs, wovon 90 % hepatozelluläre Karzinome (HCCs) sind, ist weltweit der fünfthäufigste und dritttödlichste Tumor. Eine hohe Heterogenität und spät auftauchende Symptome erschweren die Entwicklung effizienter Therapien gegen HCCs. Transforming growth factor beta (TGF-β) ist ein multifaktorielles Zytokin und ein wichtiger Regulator chronischer Lebererkrankungen, die in HCC resultieren können. TGF-β, ein Tumorsuppressor in der Krebsentstehung, kann tumorfördernde Eigenschaften während der Krebsprogression annehmen. Diese duale Rolle und die hohe Heterogenität des HCCs erzeugen eine hohe Komplexität bezüglich des TGF-β-Signalweges während der Hepatokarzinogenese. Da die TGF-β-Kaskade in HCCs häufig modifiziert ist, bietet sie einen guten Ansatzpunkt für dringend benötigte neue Therapiestrategien. Dies setzt aber ein detailliertes zeitliches und mechanistisches Verständnis des Funktionalitätswechsels von TGF-β voraus.

Vor diesem Hintergrund wurde eine systematische Analyse der zytostatischen TGF-β- Wirkung sowie möglicher Resistenzmechanismen in zehn häufig verwendeten Leberkrebs-zelllinien durchgeführt. TGF-β induzierte über Smad3 Zelltod oder Proliferationsinhibition in einer Gruppe von Zelllinien mit niedriger Expression von TGF-β1 und dessen Inhibitor Smad7, aber erhöhten TGF-β Rezeptor II (TβRII)-mRNA-Mengen (PLC/PRF/5, Hep3B, HuH7, HepG2). TGF-β-Behandlung führte zu einer starken Induktion der Smad3 und TβRI-Expression, der Smad3-Transkriptionsaktivität sowie der Expression der Zielgene Bim, PAI-1 und Smad7. Diese Zelllinien wurden bereits zuvor einer Gruppe zugeordnet, die korrelierend mit einer besseren Prognose für Patienten sogenannte frühe TGF-β-Zielgene exprimiert. Die zweite Gruppe (HLE-, HLF-, FLC-4- und zum Teil HuH6-Zellen) war resistent gegen TGF-β induzierte Zytostase und zeigte hohe Smad7- und TGF-β1-, aber niedrige TβRII-Expression und eine abgeschwächte TGF-β-induzierte Smad3-Transkriptionsaktivität. Zudem besaßen außer HuH6 alle Zelllinien dieser Gruppe eine hohe Migrationsfähigkeit. HCC-M- und HCC-T-Zellen zeigten Charakteristika beider Gruppen: Trotz Resistenz gegen zytostatische TGF-β-Effekte waren die TGF-β1-, Smad7-, aber auch TβRII-mRNA-Niveaus niedrig. Eine abschließende Analyse von Patientenproben zeigte in 59 % aller HCCs eine Smad7-Überexpression, die in HBV-assoziierten Proben aus China mit der Tumorgröße korrelierte.

Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass HCC-Zelllinien bezüglich der zyto-statischen TGF-β-Antwort zwei Hauptgruppen zugeordnet werden können, die klare Unterschiede in basalen und TGF-β-induzierten Expressionsmustern von TGF-β-Signalkomponenten und Zielgenen aufweisen. Die Daten weisen darauf hin, dass Smad7-Überexpression ein wichtiger Mechanismus zur Entwicklung einer Resistenz gegen zytostatische TGF-β-Effekte in transformierten Hepatozyten zu sein scheint. Eine so etablierte Resistenz könnte zur Entwicklung eines bösartigeren Phänotyps führen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wölfl, Prof. Dr. Stefan
Place of Publication: Deutschland
Date of thesis defense: 10 July 2013
Date Deposited: 11 Jul 2013 08:59
Date: 2013
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Mannheim > Medizinische Klinik - Lehrstuhl für Innere Medizin II
The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Leberkrebs, Transforming Growth Factor beta, Onkologie, Apoptosis, Proliferation
Uncontrolled Keywords: Hepatocellular carcinoma, TGF-beta, translational, cytostasis, Smad3
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