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Analysis of the function of histone deacetylases in neuro- and gliogenesis in embryonic mouse forebrain

Weißmüller, Kathrin

German Title: Analyse der Funktion von Histon-Deacetylasen in Neuro- und Gliogenese im embryonalen Maus-Vorderhirn

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PDF, English (Dissertation Kathrin Weißmüller)
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Abstract

In this project the role of histone deacetylases (HDACs) in neuro- and gliogenesis in embryonic mouse brain was investigated. We could show that in differentiating neural progenitor cells many different HDACs are expressed and that pharmacological inhibition of class I and II HDACs with trichostatin A led to a decrease in neurogenesis in the basal ganglia and an increase in premature astrogliogenesis (Shaked et al. 2008). The expression of most class I and II HDACs could be confirmed in embryonic cortex, GE and hippocampus. To better understand which signaling pathway is mediating the effect of HDACs on neuro- and astrogliogenesis, a real time RT-PCR analysis of candidate genes was carried out using neurosphere cultures derived from E 15.5 ganglionic eminence (GE). I found genes involved in Bmp2/4 signalling to be transcriptionally regulated upon HDAC inhibition, hints to the assumption that inhibition of HDACs by TSA releases an inhibition of BMP signalling. Stat1 and Stat3, transcription factors known to promote astrogliogenesis, were upregulated upon HDAC inhibition which corresponds to our observation of an increase in premature astrogliogenesis. The analysis of signaling pathways was further complemented by a microarray gene expression study carried out in collaboration with Dr. Catharina Scholl. In order to understand which HDACs are responsible for the effect on neurogenesis, RNA interference was used to inhibit the expression of individual HDAC genes. ShRNA against HDAC1, -2, -4, and -5 was generated and expressed in neural precursor cultures via lentiviral vectors. For all HDACs examined one shRNA oligo was found which knocked down transcription by at least 50%. However, real time RT-PCR revealed that the oligos also influenced expression of non-target HDACs. Knock-down of HDAC2 could be confirmed on the RNA and protein level, however, no effect on neuro- and gliogensis could be observed upon shRNA knock down of HDAC2. Recently generated knockout mouse models of individual HDAC genes provide a powerful tool to analyze the effect of individual HDACs on neuro- and gliogenesis. 7 HDAC4 and -5 show high expression levels in brain tissue, therefore I investigated brain development and morphology in mutant animals deficient in these enzymes. A detailed analysis of the subcellular localization of HDAC4 revealed the presence of the enzyme in neurogenic regions of the developing brain, therefore proliferation in the ventricular zone and basal progenitors in the SVZ were subsequently examined in Hdac4-/-. A slight increase in proliferation in rostral cortex could be observed, but no change in basal progenitors. I found HDAC5 to be expressed in the cortical plate and subplate and decided to examine cortical layering in HDAC5 mutants. No difference in the expression of specific layer markers could be observed between wildtype and Hdac5 null mouse.

Translation of abstract (German)

Die Zielsetzung dieses Projektes war die Untersuchung der Rolle von Histondeacetylasen (HDACs) in der Neuro- und Gliogenese im embryonalen Mausvorderhirn. Wir haben gezeigt, dass in sich differenzierenden neuralen Vorläuferzellen eine Reihe verschiedener HDACs exprimiert werden, und, dass die pharmakologische Hemmung von HDACs der Klassen I und II mittels Trichostatin A zu einer verringerten Neurogenese in den Basalganglien und vermehrter Astrogliogenese führt (Shaked et al. 2008). Die Expression der meisten HDACs der Klassen I und II konnte im Cortex, den ganglionischen Eminenzen (GE) und im Hippocampus des Embryos nachgewiesen werden. Zum Zwecke eines tieferen Verständnisses der den Effekt von HDACs auf Neuro- und Astrogliogenese vermittelnden Signaltransduktionswege wurde die Expression relevanter Gene in E 15.5 GE-Neurosphärenkulturen untersucht. Dabei habe ich festgestellt, dass im Bmp2/4-Signalweg involvierte Gene transkriptionell durch HDACs reguliert werden, was zu einer Aktivierung dieses Pathways führt. Die astrogliogenen Transkriptionsfaktoren Stat1 und Stat3 wurden nach HDAC-Hemmung verstärkt exprimiert, was mit unserer Beobachtung einer erhöhten Astrogliogenese konsistent ist. In Zusammenarbeit mit Dr. Catharina Scholl wurden die beteiligten Pathways weiter mit Hilfe von Microarray-Genexpressionsanalysen beleuchtet. Um die spezifische Rolle einzelner HDACs für die Neurogenese zu untersuchen, wurden die entsprechenden Gene mittels RNA-Interferenz reprimiert. Spezifische shRNA gegen HDAC1, -2, -4 und -5 wurde über lentivirale Vektoren in neurale Vorläuferzellen eingebracht und exprimiert. In allen Fällen fand sich unter den getesteten Oligonucleotiden eine Sequenz, die die Transkription um mindestens 50% reduzierte. Allerdings zeigte sich durch Real Time RT-PCR, dass die Oligos unspezifisch auch die Expression anderer HDACs beeinflussten. HDAC2-Knock-down konnte auf der Transkript- und Proteinebene nachgewiesen werden, allerdings ohne beobachtbare Auswirkungen auf Neuro- oder Gliogenese. 5 In jüngerer Vergangenheit erzeugte HDAC-Knockouts in Mäusen bieten vielfältige Möglichkeiten zur Untersuchung der Effekte einzelner HDACs auf die Bildung von Neuronen und Glia. Die HDACs 4 und 5 werden stark im Gehirn exprimiert, weswegen ich dessen Entwicklung und Morphologie in Mausmutanten untersucht habe, die diese Enzyme nicht mehr exprimieren. Die detaillierte Analyse der subzellulären Lokalisation von HDAC4 zeigte, dass das Enzym in den neurogenen Regionen des sich entwickelnden Gehirns vorhanden ist, worauf die Zellproliferation in der ventrikulären und subventrikulären Zone (SVZ) von HDAC4-Null-Mäusen weiter untersucht wurde. Im rostralen Cortex konnte ein leichter Anstieg der Proliferation beobachtet werden, nicht jedoch bei den basalen Vorläuferzellen der SVZ. Da ich festgestellt habe, dass HDAC5 sowohl in der Kortikal- als auch in der Subplatte exprimiert wird, beschloss ich, die kortikale Schichtung der HDAC5-Mutanten zu untersuchen. Hierbei zeigten sich keine Unterschiede in der Expression spezifischer Schichtmarker zwischen dem Wildtyp und der HDAC5-Null-Mutante.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bading, Prof. Dr. Hilmar
Date of thesis defense: 3 July 2013
Date Deposited: 07 Aug 2013 13:51
Date: 2013
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
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