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Herstellung infektiöser in vitro Transkripte und Volllängen cDNA Klone von Apple stem pitting virus (ASPV) und Apple stem grooving virus (ASGV) und Untersuchungen zur jahreszeitlichen Nachweisbarkeit dieser Viren im Apfelbaum

Arntjen, Anja

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PDF, German
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Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein infektiöser Volllängen cDNA Klon des Apple stem pitting virus (ASPV) hergestellt werden, mit dem die Ätiologie der hervorgerufenen Krankheitsbilder untersucht werden kann. Dazu sollte zum einen die klassische Methode der Ligationsstrategie genutzt werden. Sie basiert auf spezifischen Restriktionsschnittstellen mit deren Hilfe das Genom aus mehreren Fragmenten im Zielvektor zusammengesetzt wird (Prüfer et al. 1995). Für diese Methode ist es unerlässlich die komplette Sequenz des Virus zu kennen, um die Restriktionsschnittstellen auswählen zu können. Zum anderen sollte eine Methode entwickelt werden, die weniger zeit- und kostenintensiv ist und die Probleme, die in der Ligationsstrategie auftreten können, umgeht. Dazu gehört die hohe Sequenzvariabilität, die bei den latenten Apfelviren auftritt, welche dazu führt, dass das verwendete Isolat vorher sequenziert werden muss (Yoshikawa 2009). Des Weiteren können die während der Ligationsstrategie entstandenen Konstrukte in den Bakterien instabil oder toxisch sein (Ülper et al. 2008). Die entwickelte Methode sollte auf das Apple stem grooving virus (ASGV) angewendet werden. Für die Herstellung eines Volllängen cDNA Klons des ASPV wurde das Isolat PB66 verwendet. Die Ligationsstrategie wurde mit Hilfe der Sequenz des Isolates PA66 entwickelt. Bereits während der Amplifikation mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) traten Probleme auf, die dazu führten, dass die komplette Sequenz des Isolates PB66 bestimmt wurde. Dabei stellte sich heraus, dass die beiden Isolate eine Sequenzidentität von 80 % haben. Anhand der neuen Sequenz wurde eine Ligationsstrategie entwickelt, mit der erfolgreich ein Volllängen cDNA Klon des ASPV unter der Kontrolle des 35S Promotors hergestellt werden konnte. Das Konstrukt wurde in einem weiteren Schritt in einen pBin Vektor umligiert. In den anschließenden Infektionsversuchen mittels mechanischer Inokulation und Agroinokulation war dieser nicht infektiös. Die Sequenzierung des entstandenen Volllängen cDNA Klons zeigte ein verändertes 5'- Ende und 19 weitere Basenaustausche innerhalb der Sequenz. Als weitere Methode sollte die Volllängen PCR genutzt werden, dazu wurden Primer am 5'- und 3'- Ende des ASPV Isolates PB66 abgeleitet. Beim Vergleich von 5'- und 3'- Enden von verschiedenen ASPV Isolaten konnte eine erhöhte Konserviertheit festgestellt werden, welche es ermöglicht, die erstellten Primer zur Herstellung von 15 Volllängen PCR Produkten von verschiedenen ASPV Isolaten zu nutzen. In der PCR konnte das komplette Genom amplifiziert werden. Die Ligation des 9 kb großen PCR Fragmentes gelang nicht. Als Abänderung in der Volllängen PCR wurde dem 'forward' Primer die Sequenz des T7 Promotors angefügt. Dadurch konnten in der T7 PCR infektiöse RNA Transkripte generiert werden. Die Volllängen PCR wurde auf ASGV angewendet. Es konnte das komplette 6,5 kb große Genom amplifiziert werden. Die Ligation des PCR Produktes war auch hier nicht erfolgreich. Durch Hinzufügen des T7 Promotors an den 'forward' Primer konnten mit den Volllängen PCR Produkten in der T7 PCR infektiöse Transkripte hergestellt werden. Durch mechanische Inokulation mit den T7 PCR Ansätzen konnten in beiden Fällen in dem experimentellen Wirt Nicotiana occidentalis 37B Symptome ausgelöst werden. Die Infektion mit ASPV und ASGV wurde durch PCR Nachweise und elektronenmikroskopische Untersuchungen belegt. Als weitere Methode wurde das Circular Polymerase Extension Cloning (CPEC) verwendet (Quan and Tian 2009). Hierbei wurde an die Primer für die Volllängen PCR ein Stück Vektorsequenz angehängt. Diese überlappenden Bereiche dienen in einer Fusions- PCR als Ausgangspunkt für die Polymerase. Mit Hilfe dieser Methode konnten infektiöse Volllängen cDNA Klone des ASPV und ASGV in einem pBin Vektor hergestellt werden. Nach Agroinokulation zeigten sich auf den Versuchspflanzen Symptome. Die Infektion wurde durch PCR und das Elektronenmikroskop belegt. Die Infektionsrate lag bei dem ASPV Klon bei 3 % und bei dem ASGV Klon bei 22 %. In dieser Arbeit wurden infektiöse Volllängen cDNA Klone der latenten Apfelviren ASPV und ASGV mit der CPEC Methode hergestellt. Beide Klone könnten in weiteren Versuchen für die Erforschung der Ätiologie der durch die Viren hervorgerufenen Krankheiten genutzt werden. Des Weiteren wurde ein Versuch zur Nachweisbarkeit von ASPV über den gesamten Jahresverlauf in verschiedenen Apfelbaumgeweben durchgeführt, in dem sich Phloem als das zuverlässigste Gewebe zur Detektion von ASPV gezeigt hat. Die Nachweisbarkeit von ASPV, Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) und ASGV in Mischinfektionen wurde ebenfalls über einen längeren Zeitraum überprüft.

Translation of abstract (English)

In this work an infectious full- length cDNA clone of Apple stem pitting virus (ASPV) was generated to give the possibility to study the aspects of the disease in different host plants. For the generation two strategies were followed. The first strategy was the classical ligation strategy, which is based on specific restriction sites inside the genome (Prüfer et al. 1995). These sites are used to ligate several amplified fragments of the genome into a plasmid containing the 35S promoter to construct the full- length clone. This strategy requires the knowledge of the complete sequence of the virus. Latent apple virus genomes show high sequence variability, which makes it necessary to determine the sequence prior to the development of a ligation strategy. Besides this there could be problems with stability and toxicity of the generated contructs in bacteria (Ülper et al. 2008). The second strategy should be less time and cost intensive than the ligation strategy. In addition it should circumvent the stability and toxicity problems. The ASPV isolate PB66 was used for the generation of the full- length cDNA clone, but the ligation strategy was based on the sequence of isolate PA66. Due to problems with the amplification of polymerase chain reaction (PCR) fragments the whole sequence of PB66 was determined. ASPV PA66 and PB66 share 80% sequence identity. A new ligation strategy was developed. With this strategy a fulllength cDNA clone of PB66 was generated under the control of the 35S promoter. The construct was not infectious. The full- length clone was sequenced and a change at the 5'- end and 19 base exchanges were determined in the sequence. The second strategy was based on full- length PCR. Therefore primers at the 5'- and 3'- end were designed. The 5'- and 3'- end are highly conserved among different ASPV isolates, which provide the usage of a primer pair to generate full-length PCR products of different ASPV isolates. The whole genome was amplified during PCR, but ligation of the 9kb fragment into a plasmid failed. This full- length PCR protocol was also used for Apple stem grooving virus (ASGV). The whole genome 6,5 kb in size was amplified, but ligation also failed. The T7 promoter was fused to 5'- end primer and full- length products were generated. Full-length RNA transcripts were generated in vitro of both apple viruses. They were infectious in the experimental host Nicotiana occidentalis 37B. The infection was proven by PCR and electron microscopy. 17 The circular polymerase extension cloning (CPEC) was used to generate full- length cDNA clones of ASPV and ASGV (Quan and Tian 2009). Therefore, vector sequences were fused to the primers of the full length PCR. These overlapping sequences are used as start for the polymerase in a fusion- PCR. After agroinoculation both full- length cDNA clones were infectious. The infection was proven by PCR and electron microscopy. The full- length clone of ASPV showed an infection rate of 3%. The infection rate of the full- length ASGV clone was 50%. In this work infectious full- length cDNA clones of ASPV and ASGV were generated with the CPEC method. Therefore, the CPEC method is a reliable method to generate full- length cDNA clones of different apple viruses. Both clones can be used to study the aspects of the diseases. In addition virus RNA extractions were made from buds or leaves, phloem, and roots from four different trees at monthly intervals throughout the year followed by RT-PCR tests for evaluation of seasonal detection reliability for ASPV. In tests using published ASPV primers phloem was the most reliable tissue for detecting the virus throughout the year in 20 year old trees. Mixed infections of ASPV, ACLSV and ASGV were established by grafting onto young apple trees. These were examined monthly by RT-PCR for the three viruses, beginning one year after infection. The results showed that April was the preferable month for virus detection in leaves while analyses in the summer months were less reliable.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jelkmann, Prof. Dr. Wilhelm
Date of thesis defense: 29 October 2013
Date Deposited: 21 Nov 2013 09:34
Date: 2013
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Malus, Pflanzenviren
Uncontrolled Keywords: Apple stem pitting virus, Apple stem grooving virus, Volllängen cDNA Klon, Circular Polymerase Extension Cloning
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