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Die Untersuchung der Erkennung von Plasmopara viticola durch VRP1 Rezeptoren und der Regulation der Pathogenabwehr durch die Transkriptionsfaktoren VvWRKY33 und VvERF5 in der Weinrebe (Vitis sp.)

Merz, Patrick Roman

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PDF, German
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Abstract

Die Weinrebe (Vitis vinifera L. ssp. vinifera) gehört zu den bedeutendsten Kulturpflanzen weltweit. Ihre hohe Anfälligkeit für eine Vielzahl von Pathogenen, insbesondere dem Echten (Erysiphe necator) und Falschen Mehltau (Plasmopara viticola), ist für den Weinbau eine besondere wirtschaftliche Bedrohung und kann zu erheblichen Ernteausfällen führen. Nicht zuletzt darum werden in Europa zwei Drittel der Gesamtmenge an Fungiziden im Weinbau eingesetzt. Um den Fungizideinsatz zu reduzieren, sollen neue resistente Rebsorten (z.B. `Regent´) gezüchtet werden, wobei es sich bei der angewendeten klassischen Kreuzungszüchtung um ein langwieriges Verfahren handelt. Die Mechanismen, welche in den resistenten Rebsorten die gesteigerte Resistenz vermitteln, sind jedoch größtenteils unbekannt. Die Identifikation sowie die funktionelle Charakterisierung von Genen, welche an der Regulation von Resistenzmechanismen beteiligt sind, könnte somit zur Verbesserung und Beschleunigung der Züchtung neuer resistenter Rebsorten beitragen. Mittels Mikroarrays konnte eine Reihe von Genen identifiziert werden, darunter auch Rezeptoren und Transkriptionsfaktoren (TF), welche in resistenten Rebsorten im Vergleich zu anfälligen Rebsorten eine schnellere und stärkere Induktion zeigten, von denen aber bislang nur vereinzelte Gene funktionell charakterisiert werden konnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Funktion einer Rezeptorfamilie bei der Abwehr von P. viticola nachgewiesen sowie anschließend die Unterschiede der transkriptionellen Regulation der Resistenzantwort durch TFs zwischen einer anfälligen und einer resistenten Rebsorte untersucht. Hierzu wurden im ersten Teil des Projektes die Gene der VRP1 (Vitis Resistance to Plasmopara 1) Rezeptorfamilie charakterisiert. Der in silico Vergleich der drei chimären VRP1 Rezeptoren zwischen der anfälligen Rebsorte `Lemberger´ und der resistenten Rebsorte `Regent´ zeigte keine Sequenzunterschiede. Die Lokalisation der VRP1 Proteine nach Fusion mit dem Grün Fluoreszierenden Protein (GFP) in Protoplasten einer Suspensionskultur (V. vinifera cv. `Chardonnay´) mittels konfokaler Mikroskopie konnte belegen, dass sich alle drei VRP1 Konstrukte im Cytoplasma befanden. Zusätzlich konnte mittels qPCR Analyse nachgewiesen werden, dass die Rezeptoren im resistenten `Regent´ im Vergleich zum anfälligen `Lemberger´, spezifisch durch Infektion mit P. viticola induziert wurden, was auf eine Funktion bei der Abwehr von P. viticola schließen lies. Die transiente Transformation der VRP1 Gene in Weinrebenblätter mit anschließender P. viticola Infektion zeigte, dass die Expression von VRP1-3 eine Steigerung der Resistenz um bis zu 50 % bewirkte. Darüber hinaus wurden die VRP1 Gene stabil in Arabidopsis thaliana transformiert. In Folge der Überexpression von VRP1-3 konnte ebenfalls eine Verbesserung der Resistenz der transgenen Arabidopsis Pflanzen gegen Hyaloperonospora arabidopsidis um bis zu 50 % detektiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Induzierbarkeit des Resistenzgens VvPR10.1 (Pathogenesis Related 10.1) durch TFs und ihre Auswirkung auf die Resistenz untersucht. Mittels Promotor Induktionsanalyse konnte gezeigt werden, dass die TFs VvWRKY33, VvERF5 und VvCZF1 den Promotor von VvPR10.1 induzieren konnten, was auf eine Rolle in der Abwehr hindeutete. Es konnte zusätzlich in vivo gezeigt werden, dass eine durch P. viticola Infektion hervorgerufene Induktion von VvWRKY33 in Weinrebenblättern von Gewächshausreben wiederum zur Steigerung der Expression von VvPR10.1 führte. Ektopische Expression der TFs in Weinrebenblättern mit anschließender P. viticola Infektion zeigte, dass die Expression von VvWRKY33 und VvERF5 eine Steigerung der Resistenz um 50-70 % bewirkte. Außerdem konnte durch Komplementierung der A. thaliana knock out Mutante wrky33-1 mit VvWRKY33 nachgewiesen werden, dass die Expression im heterologen System Arabidopsis den Phänotyp des Wildtyps, in Bezug auf die Resistenz, wiederherstellen konnte. Darüber hinaus konnte sogar eine signifikante Steigerung der Resistenz gegen H. arabidopsidis und Botrytis cinerea im Vergleich zum Wildtyp Col-0 erreicht werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass die gezielte Expression des VRP1-3 Rezeptors sowie der TFs VvWRKY33 bzw. VvERF5 in der Weinrebe, eine gesteigerte Resistenz gegen P. viticola induzieren konnten. Dies stellt eine Basis für die Aufklärung der zugrunde liegenden Resistenzmechanismen, und somit für die Entwicklung neuer molekularer Marker zur Verbesserung und Beschleunigung der Züchtung neuer resistenter Rebsorten, dar.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Rausch, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 3 June 2014
Date Deposited: 13 Jun 2014 11:16
Date: 2014
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
580 Botanical sciences
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