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Identification and Pluripotency of Mouse Spermatogonial Stem Cells

Azizi, Hossein

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Abstract

Spermatogonial stem cells (SSCs) are located on the basal membrane in seminiferous tubules of the testis and are responsible for sperm production during the male’s life. Although the morphology and kinetics of spermatogonia has been extensively characterized, there is still a lack of specific cellular, morphological and biochemical criteria for SSCs. However, Fluorescence-activated cell sorting (FACS), magnetic-activated cell sorting (MACS), matrix selection and morphology-based selection are some of the useful methods for the isolation of SSCs. In the current study, we demonstrated that using cell sorting approaches are dispensable for the generation of mouse SSCs cultures. We identified a simple and highly reproducible protocol for the isolation of SSCs with morphology-based selection and successfully established two types of SSCs (Type I and Type II). Using co-culture systems with different mitomycin-C treated feeder layers in long-term culture, we established the optimal conditions for the cultivation and gene expansion of these two types of SSCs. We successfully expanded Type I SSCs on mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and Type II SSCs on both SNL and primary testicular stroma cells (TSCs) feeders. Electron microscopic analysis revealed that Type I SSCs display a similar morphology with SSCs in-vivo high nucleus/cytoplasm ratio, while Type II SSCs have a different morphology small nucleus/cytoplasm ratio. Immunocytochemistry, FACS and Fluidigm real-time RT-PCR results showed that Type I SSCs clearly express germ cells markers while Type II SSCs only partially express the typical germ cell profile of SSCs. Following the transplantation of Type II SSCs to busulphan-treated NOD/ SCID mice, we observed a localization of GFP-labeled cells in the basal compartment of the seminiferous tubule. Furthermore, GFP labeled sperms were detected in epididymis. Among the most obvious molecular differences between Type I and Type II SSCs were their reprogramming capacity to mouse embryonic stem cells-(ES-) like cells that occurred only on the critical time window after initiation of Type I SSCs culture. Although testis-derived ES-like cells have been obtained in several studies, the time window for the shift to pluripotency was not clearly determined. In our experiments, we observed that the spontaneous appearance of germline-derived ES-like cells from both neonate and adult Type I cells occurred only during a special time window (41 until 125 days) after initiation of Type I cells from neonate and adult promoter-reporter Oct4-GFP transgenic mice. The generated ES-like cells expressed pluripotency markers, differentiated into all three germ lineages, formed complex teratoma after transplantation in SCID mice and produced chimeric mice. Although the exact mechanism of the development of ES-like cells from GSCs is still unclear, this new information could provide an ideal strategy for scheduling natural conversion mechanisms of ES-like cells from mouse testes. Therefore, the two different types of SSCs could provide an ideal cell system for studying both pluripotency and in-vitro differentiation of SSCs to sperm and also provide a new strategy for isolation of SSCs from neonatal and adult mice by morphology-based selection.

Translation of abstract (German)

Spermatogoniale Stammzellen (SSCs) sind in den Samenkanälchen des Hodens lokalisiert und für die Samenproduktion des Mannes verantwortlich. Obwohl viel über die Morphologie und Kinetik der Spermatogonien bekannt ist, so gibt es doch noch Lücken in der Erforschung von spezifischen zellulären, mophologischen und biochemischen Prozessen der SSCs. Methoden wie die Durchflusszytometrie (FACS), Magnetic Cell Separation (MACS), die Matrix-Selektion und die Selektion aufgrund morphologischer Kriterien sind einige der sehr hiflreichen Techniken, um SSCs aus dem Hodengewebe zu isolieren. Wir generierten ein einfaches, aber höchst reproduzierbares Protokoll für die Isolierung von SSCs. Es handelt sich um eine Selektion, die auf der Morphologie der Zellen basiert und mit deren Hilfe wir zwei Typen von SSC-Zellen (Typ I und Typ II) selektieren konnten. Wir etablierten die optimalen Wachstumsbedingungen für diese zwei Zelltypen, indem wir Ko-Kulturen mit verschiedenen Mitomycin-C behandelten Feederzellen als Langzeitkultur ausgetestet haben. Damit konnten wir erfolgreich „Typ I-SSCs“ auf embryonalen Fibroblasten der Maus (MEFs) und „Typ II-SSCs“ auf SNL-Fibroblasten (generiert aus STO-Fibroblasten der Maus), aber auch auf primären testikulären Stromazellen der Maus (TSCs) wachsen lassen. Elektronenmikroskopische Analysen zeigten, dass Typ I-SSCs eine ähnliche Mophologie mit SSCs in-vivo, mit einem typischen Kern-/Zytoplasma-Verhältnis aufweisen, während Typ II-SSCs eine unterschiedliche Morphologie in Bezug auf das Kern-/Zytoplasma-Verhältnis besitzen und einen eher kleinen Kern aufweisen. Die Ergebnisse von Untersuchungen mittels Immunhistologie, FACS und Fluidigm Real Time PCR zeigten deutlich, dass Typ I-SSCs Keimzellmarker exprimieren, während Typ II-SSCs nur partiell das Keimzellmarkerprofil aufwiesen. Weiterhin konnte man bei Busulfan-behandelten Tieren beobachten, dass transplantierte GFP-positive Typ II-SSCs an der Basalmembran der Hodenkanälchen lokalisiert sind. Ebenfalls wurden GFP-positive Spermien im Nebenhoden gefunden. Zu den größten Unterschieden zwischen Typ I- und Typ II-SSCs gehört ihre Fähigkeit, sich wieder zu embryonalen Stammzell- ähnliche Zellen (ES- ähnlichen Zellen) zu reprogrammieren. Dies tritt in einem kritischen Zeitfenster auf, nachdem die Typ I-SSC-Kulturen angelegt wurden. Obwohl man in verschiedenen Studien ES-ähnliche Zellen aus dem Hoden generieren konnte, so konnte das Zeitfenster, in der sich der Übergang in pluripotente Zellen ereignet, bislang nicht klar definiert werden. In unseren Experimenten konnten wir das spontane Auftreten von ES-ähnlichen Zellen aus Typ I-SSC Zellen sowohl aus neugeborenen, als auch aus erwachsenen Mäusen beobachten, aber nur während eines speziellen Zeitfensters (Tag 41 bis Tag 125, nachdem die Typ I-SSC Zellkulturen aus neugeborenen und erwachsenen Promotor-Reporter Oct4-GFP transgenen Mäusen angelegt wurden). Die so erzeugten ES-ähnlichen Zellen reagierten positiv auf Pluripotenzmarker. Diese ließen sich in-vitro in alle drei Keimbahnen differenzieren und bildeten komplexe Teratome, nachdem sie in NOD/SCID Mäuse injiziert wurden und produzierten chimäre Mäuse. Obwohl der exakte Mechanismus der Entwicklung der ES-ähnlichen Zellen aus SSCs noch unklar ist, bieten diese neue Beoachtungen die Möglichkeit, etwas Neues über den Ablauf der Umwandlung der ES ähnlichen Zellen aus Mäusehoden zu erfahren. Daher bieten diese zwei Zelltypen I und II ein ideales Zellsystem, um sowohl Pluripotenz als auch die in-vitro Differenzierung der SSCs zu Spermien zu erforschen. Darüber hinaus findet sich hiermit eine neue Strategie, um SSCs von neugeborenen und erwachsenen Mäusen anhand von morphologischer Selektion zu isolieren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Skutella, Prof. Dr. med. Thomas
Date of thesis defense: 5 August 2014
Date Deposited: 01 Sep 2014 08:40
Date: 2014
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
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