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Identification and characterization of novel regulatory genes of post-embryonic hematopoiesis

Hemmati, Shayda

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Abstract

Comprehensive integration site analysis for monitoring the clonal dynamics in clinical gene therapy has revealed that the insertion of the therapeutic retroviral vector (RV) can deregulate and even substantially activate neighboring genes leading to selection advantage and clonal outgrowth. Strikingly, 7 out of 10 Wiskott Aldrich Syndrome (WAS) gene therapy patients developed acute leukemia driven by gene corrected cell clones aberrantly expressing LMO2, MDS1 or MN1. This indicates that RV-mediated activation of adjacent regions cannot only influence the fate of hematopoietic stem cells but also cause clonal dominance up to leukemia. To identify novel regulators of benign hematopoiesis we established a systematic selection strategy using the total genomic integration site dataset of normal and highly polyclonal clinical blood and bone marrow samples. In this thesis, the unique integration site (IS) dataset within a cohort of 10 WAS gene therapy patients was systematically analyzed to select for candidate genes involved in the regulation of hematopoiesis. Initially, a total of 12.887 unique IS in vicinity of 3.267 genes were identified. Next, we selected all genes with at least 10 different IS within a 200 kb window around the gene (n=588). To enrich for genes with increased probability of transcriptional activation we then chose those genes with at least 10 IS within a 50kb window around the transcriptional start site (n=424). After stringent exclusion of all genes located within gene clusters 32 candidate genes were identified. To evaluate the hematopoietic activity of gene corrected cell clones, their contribution to blood cell formation within four years post gene therapy was monitored. We observed that these clones were detectable 15 to 93 times in a total of 102 individually analyzed patient samples, demonstrating long term activity of these hematopoietic stem cell clones. Interestingly, 20 out of the 32 highest ranked genes such as EVI1, CCND2 and LMO2 are known hematopoietic key regulators, strongly validating our selection strategy. After identification of 12 novel hematopoietic regulatory candidate genes, the top five ranked genes, ZNF217, LRRC33, PLCB4, EVL and IRF2BPL were chosen for further functional analysis in murine hematopoietic primary cells. To evaluate the endogenous expression of candidate genes in murine hematopoietic stem and progenitor cells global transcriptome datasets from purified populations were evaluated. We observed that all five selected candidate genes were expressed in at least one out of the five analyzed hematopoietic stem and progenitor cell populations which may point to an important role in the respective cell fraction. In order to validate our selection II strategy and to further investigate whether the chosen candidate genes play roles in hematopoiesis, we performed various in vitro and in vivo assays. We tested the effect of the selected candidate genes on proliferation, differentiation, and cytokine independency as well as for their influence on long term multilineage reconstitution and self-renewal after murine bone marrow transplantation. The first candidate gene, ZNF217, is a zinc finger protein known as a transcription factor. To analyze the impact of ZNF217 on transcriptional activity, global gene expression profiling in hematopoietic cells was performed. We observed that 337 out of 422 genes were significantly downregulated and that they are mainly involved in cellular movement indicating that ZNF217 plays a role in hematopoietic cell migration. Since ZNF217 is known as a proto-oncogene in breast and ovarian carcinoma we evaluated its effect on growth factor independency of hematopoietic cells. Interleukin 3 (IL3)-dependent cells overexpressing ZNF217 acquired the capacity to survive and form colonies in the absence of IL3 suggesting a transforming role for ZNF217 in hematopoietic cells. The second candidate LRRC33 resembles the protein structure of Toll-like receptor (TLR) proteins which are involved in innate immunity. The overexpression of LRRC33 and TLR4 decreased the activity of NF-κB in vitro when stimulated with bacterial lipopolysaccharide. This may point to an inhibitory role of LRRC33 in NF-kB signaling, an important pathway for maintaining stem cell integrity. Transplanted LRRC33-overexpressing LSK (Lin-Sca-1+cKit+) cells gave rise to a 1.3-6.7-fold lower ratio of T-cells and in contrast a 1.1-7.2-fold higher amount of donor derived macrophages in secondary recipients compared to control mice. To study the function of the third candidate gene on hematopoiesis constitutive PLCB4 knockout mice were obtained. This phospholipase has been shown to be important for brain development but has not been linked to hematopoiesis so far. Preliminary results indicate that PLCB4 deficient mice have a reduced LSK cell fraction compared to age matched littermates within the first 18 days after birth. These results demonstrate that clinical integration site datasets can be used to identify regulatory genes of hematopoiesis. Here, we identified ZNF217 as a driver of hematopoietic transformation applying the established selection strategy. In total, we could show that four out of five candidate genes play a role in hematopoiesis and they will be further evaluated for their stem cell regulatory potential. Systematic identification of novel regulatory genes in meta-datasets derived from a larger number of gene therapy studies and subsequent validation in vitro and in vivo will allow to gain new insights into the biology of post-embryonic hematopoiesis.

Translation of abstract (German)

Umfassende Integrationsstellen (IS)-analysen zur Beobachtung der klonalen Zusammensetzung in Gentherapie-Studien haben gezeigt, dass die Insertion des therapeutischen retroviralen Vektors (RV) benachbarte Gene durch transkriptionelle Aktivierung deregulieren kann. Dies kann zu einem Selektionsvorteil und klonalem Auswachsen bestimmter Zellklone führen. Auffallenderweise haben 7 von 10 Gentherapie-Patienten mit Wiskott-Aldrich Syndrom eine akute Leukämie entwickelt, die von Gen-korrigierten Zellklonen mit aktivierenden Vektor-Insertionen vor den Genen LMO2, MDS1 oder MN1 getrieben wurden. Dies weist darauf hin, dass die RV initiierte Aktivierung benachbarter Genregionen nicht nur das Schicksal hämatopoetischer Stammzellen beeinflussen, sondern auch klonale Dominanz bis hin zur Leukämie-Entstehung zur Folge haben kann. Eine systematische Analyse von klinischen IS Datensätzen und die Klassifizierung von genomischen Anhäufungen dieser IS sollte zur Identifizierung bedeutender hämatopoetischer Gene führen. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit mittels klinischer Daten von RV markierter polyklonaler Blutbildung eine Selektionsstrategie entwickelt, um bisher unbekannte Stammzellregulatoren zu ermitteln. Um Kandidaten-Gene zu identifizieren, wurde der einzigartige klinische IS Datensatz von insgesamt 12887 spezifischen IS von einer Kohorte von 10 Patienten analysiert. In der Nähe dieser individuellen Insertionen wurden 3267 Protein-kodierende Gene ermittelt. Im nachfolgenden Schritt, wurden Gene gewählt, welche mindestens 10 unterschiedliche IS in einem 200 kb Fenster um ihre Loki aufwiesen (n=588). Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die umliegenden Gene durch die Vektorinsertionen transkriptionell aktiviert wurden, wurden diese mit mindestens 10 IS in einem Bereich von 50 kb um den Transkriptionsstart gewählt (n=424). Nach stringentem Ausschluss von Genen, welche auf genomischer Ebene nicht einzeln, sondern in Gruppen lokalisiert vorliegen, wurden 32 eindeutig zuordenbare Kandidaten identifiziert. Um die hämatopoetische Aktivität dieser spezifischen Gen-korrigierten Klone zu untersuchen, wurde deren Beitrag zur humanen Blutbildung während einem Zeitraum von vier Jahren nach Gentherapie überprüft. Dabei haben wir festgestellt, dass diese Zellklone in 15 bis 93 Fällen von 102 individuell analysierten Blutproben detektiert werden konnten, was auf eine kontinuierliche hämatopoetische Aktivität dieser Klone hindeutet. Interessanterweise sind 20 der 32 Kandidaten-Gene mit den namhaften Vertretern LMO2, EVI1 und CCND2 bereits bekannte hämatopoetische Regulatoren, was unsere Auswahlstrategie immens stützt und validiert. Nach Identifizierung von 12 neuen hämatopoetischen Kandidaten-Genen wurden die fünf höchst Gelisteten zur detailierten funktionalen Untersuchung in murinen hämatopoetischen IV Primärzellen ausgewählt. Um die endogenen Expressionslevel dieser Kandidaten in definierten hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzell-Populationen zu bewerten, wurden globale Transkriptom-Daten ausgewertet. Alle fünf Kandidaten wurden in mindestens einer der fünf aufgereinigten Zellpopulationen exprimiert, was auf eine wichtige Rolle in der entsprechenden Fraktion hindeuten könnte. Um umfassender zu untersuchen, ob die ausgewählten Kandidaten-Gene Stammzell-regulatorisches Potential besitzen, wurden verschiedene in vitro und in vivo Experimente verwendet. Es wurde einerseits der Einfluss der Kandidaten auf Proliferation, Differenzierungsfähigkeit und Zytokin-Abhängigkeit, andererseits deren Auswirkung auf die Langzeitblutbildung und Selbsterneuerungsfähigkeit im lebenden Organismus untersucht. Das erste Kandidatengen ist ein Zinkfingerprotein, ZNF217, und als Transkriptionsfaktor bekannt. Um das Potential als transkriptioneller Regulator in hämatopoetischen Zellen zu untersuchen, wurden nach dessen Überexpression globale Genexpressionsanalysen durchgeführt. 337 von 422 deregulierten Genen waren signifikant herunter-reguliert und der Großteil kann in den Prozess der zellulären Bewegung eingruppiert werden, was auf eine Rolle von ZNF217 bei der Migration von hämatopoetischen Zellen hindeuten könnte. Da ZNF217 in Brust- und Ovarialkarzinomen als Proto-Onkogen beschrieben wurde, wurde sein Einfluss auf die Wachstumsfaktorunabhängigkeit in hämatopoetischen Zellen untersucht. Die Überexpression von ZNF217 führte unter Mangel von Interleukin 3 (IL3) zum Überleben und Wachstum von Zytokin-unabhängigen Kolonien, was auf eine transformierende Eigenschaft von ZNF217 in hämatopoetischen Zellen schließen lässt. Der zweite Kandidat, LRRC33 ähnelt in seiner Proteinstruktur Toll-like-Rezeptoren (TLR), welche eine Rolle in der angeborenen Immunität spielen. Es konnte gezeigt werden, dass nach Stimulierung mit bakteriellem Lipopolysaccharid in vitro die Überexpression von LRRC33 und TLR4 zu einer reduzierten Aktivität von NFκB führt. Dies deutet auf einen inhibitorischen Einfluss von LRRC33 auf das NFκB Signaling hin, was ein wichtiger Signalweg zur Erhaltung hämatopoetischer Stammzellintegrität darstellt. Die Transplantation von LRRC33 exprimierenden LSK (lin-Sca1+ckit+) Zellen ergab im Vergleich zu Kontrollmäusen eine 1,3-6,7 fach geringere Menge an T-Zellen und einen 1,1-7,2 fach höheren Anteil an Makrophagen in sekundär transplantierten Rezipienten. Um die Funktion des dritten Kandidatengens, PLCB4 zu untersuchen, wurden Knockout-Mäuse eingesetzt. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Phospholipase eine große Bedeutung während der Gehirnentwicklung besitzt, jedoch ist bisher noch kein Zusammenhang zur Blutentwicklung beschrieben worden. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass PLCB4 defiziente Mäuse einen im Vergleich zu altersgemäßen Wildtyp-Wurfgeschwistern geringeren Anteil an hämatopoetischen LSK Zellen während den ersten 18 Tagen nach Geburt aufweisen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Glimm, Prof. Dr. Hanno
Date of thesis defense: 11 August 2014
Date Deposited: 01 Sep 2014 08:11
Date: 2014
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
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