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New insights into PEXEL-mediated protein export in Plasmodium falciparum: The role of N-terminal acetylation

Deil, Sophia

German Title: Neue Einblicke in PEXEL-vermittelten Proteinexport in Plasmodium falciparum: die Rolle von N-terminaler Acetylierung

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Abstract

The apicomplexan parasite Plasmodium falciparum is the causative agent of the most severe form of malaria with more than 600 000 death cases per year, mainly among young children and pregnant women. The development of the parasite within human erythrocytes is accompanied by extensive remodelling of the host cells. The establishment of nutrient acquisition pathways, the genesis of membranous structures within the red blood cell (RBC) cytosol and the formation of a cytoadherence complex on the surface of the host cell represent important examples of these modifications that contribute both to parasite survival and virulence. For this purpose P. falciparum exports hundreds of effector proteins into the RBC with the majority of them bearing a characteristic pentameric sequence termed Plasmodium export element (PEXEL), which is cleaved in the parasite after the third and N-terminally acetylated at the fourth amino acid position. To gain a better understanding of this important export signal, a mutagenesis screen on the PEXEL motif (48RLLAQ52) of a GFP-tagged model protein (STEVOR1-80) was conducted in this study. The localization of the mutant proteins to different compartments of the parasitized erythrocyte was determined by fluorescence microscopy. In addition, mass spectrometric analysis of representative mutants confirmed a correlation between processing of the export motif and protein trafficking. In summary, amino acid replacements within position 1 (R48) and 3 (L50), representing the most conserved amino acids, had detrimental effects on PEXEL cleavage and protein export. In contrast, positions 2 (L49) and 5 (Q52) proved to be more permissive towards mutations and mostly maintained the wild-type export phenotype. Special attention was paid to position 4 (A51), which is acetylated after cleavage and appeared more restricted than originally assumed. One interesting finding was the deficiency of non-acetylated mutant proteins to be exported into the host cell indicating N-terminal acetylation as a prerequisite for proper targeting of PEXEL proteins. Consequently, the second part of this study focussed on the characterization of a putative N-acetyltransferase (PfNAT) that might be responsible for this allegedly important post-translational modification. The localization of the candidate transferase to the parasite endoplasmic reticulum, the compartment of PEXEL processing, was confirmed by single crossover integration of a GFP tag into the endogenous locus. Despite the use of two different approaches, the attempted deletion of the gene for loss-of-function studies was unsuccessful. However, a conditional downregulation of protein levels by ~50% was achieved using a destabilization domain, which facilitated further investigations.

Translation of abstract (German)

Plasmodium falciparum aus dem Stamm der Apicomplexa ist der Hauptverursacher von schwerwiegender Malaria, an der jährlich über 600 000 Menschen sterben, darunter vor allem Kleinkinder und schwangere Frauen. Während seiner asexuellen Entwicklung in menschlichen Erythrozyten modifiziert der Parasit seine Wirtszellen, was maßgeblich zu seinem Überleben als auch zu seiner Virulenz beiträgt. Der Aufbau von Nährstofftransportwegen, die Bildung eines membranösen Netzwerkes im Zytoplasma des roten Blutkörperchens sowie eines Zytoadherenzkomplexes an dessen Oberfläche stellen einige dieser Veränderungen dar. Zu diesem Zweck transportiert der Parasit hunderte von Effektorproteinen in den Erythrozyten, von denen die Mehrheit das sogenannte Plasmodium Export-Element (PEXEL) besitzt. Diese Sequenz besteht aus fünf aufeinanderfolgenden Aminosäuren, welche im Parasiten nach der 3. Position proteolytisch gespalten und daraufhin an der 4. Position N-terminal acetyliert werden. Um dieses wichtige Exportsignal besser zu verstehen, wurde in dieser Doktorarbeit das PEXEL-Motiv (48RLLAQ52) eines GFP-markierten Modellproteins (STEVOR1-80) einer ausführlichen Mutagenese unterzogen, gefolgt von einer fluoreszenzmikroskopischen Analyse zur Lokalisation der mutierten Proteine in intra-erythrozytären Parasitenstadien. Massenspektrometrische Untersuchungen an ausgewählten Mutanten konnten außerdem einen Zusammenhang zwischen enzymatischer Prozessierung des PEXEL-Motivs und dem Proteinexport nachweisen. Zusammenfassend wurde festgestellt, dass der Austausch von stark konservierten Aminosäuren an Position 1 (R48) und 3 (L50) sich nachteilig auf den Proteintransport auswirkte. Dagegen wurden Mutationen an Position 2 (L49) und 5 (Q52) überwiegend toleriert ohne den Export zu beeinflussen. Spezielles Interesse galt der Aminosäure an Position 4 (A51), welche nach der proteolytischen Spaltung acetyliert wird. Interessanterweise wurden nicht-acetylierte Proteine nicht über die parasitophore Vakuole hinaus transportiert, was auf eine wichtige Rolle von N-terminaler Acetylierung im Exportprozess hinweist. Folglich konzentrierte sich der zweite Teil der Studie auf die Charakterisierung der mutmaßlich verantwortlichen N-Acetyltransferase (PfNAT). Das Enzym konnte mit Hilfe von genetischer Integration eines GFP-Markers im endoplasmatischen Retikulum des Parasiten nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde die Deletion des Genes mit zwei verschiedenen Methoden ohne Erfolg versucht. Dennoch gelang es, die Proteinmenge von PfNAT mithilfe einer destabilisierenden Domäne um 50% zu reduzieren und für weitere funktionelle Studien zu nutzen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Lanzer, Prof. Dr. Michael
Place of Publication: Department für Infektiologie Heidelberg
Date of thesis defense: 19 September 2014
Date Deposited: 17 Nov 2014 09:40
Date: 2014
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
610 Medical sciences Medicine
Controlled Keywords: Malaria, Parasitologie, Infektionskrankheiten, Plasmodium falciparum, Proteintransport
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