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Untersuchungen zur in vitro Interaktion von Peroxisomen mit Mikrotubuli und der daran beteiligten Bindungsproteine

Thiemann, Meinolf

English Title: Investigations on the in vitro interaction of peroxisomes with microtubules and the involved binding proteins

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PDF, German
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Abstract

Ein semiquantitativer in vitro Bindungsassay, der auf der Bindung reiner Rattenleberperoxisomen an rekonstituierte Mikrotubuli, die an Mikrotiterplatten gekoppelt waren, basiert, wurde entwickelt, um die Interaktionen von Peroxisomen mit Mikrotubuli zu charakterisieren. Die spezifische Bindung der Peroxisomen an Mikrotubuli konnte mit konfokaler Laserscanningmikroskopie und Negativkontrastelektronenmikroskopie gezeigt werden. Die Bindung war konzentrationsabhängig und sättigbar und wurde von Inkubationsdauer, Temperatur und pH beeinflußt. Die Zugabe von ATP, Kinasen, Phosphataseinhibitor oder Motorproteinen erhöhte die Bindung, während ATP-Depletion oder Mikrotubuli-assoziierte Proteine sie verminderte. Eine KCl-Behandlung der Peroxisomen reduzierte die Bindung, was durch Zugabe von dialysiertem KCl-Eluat oder Rattenlebercytosol verhindert wurde. Der rekonstituierende Effekt von Cytosol wurde durch dessen Vorbehandlung mit Proteasen oder N-ethylmaleimid (NEM) aufgehoben. Weiterhin verringerte die Behandlung der Peroxisomen mit Proteasen oder NEM ihre Bindung, was nicht durch Cytosol kompensiert wurde. Dies läßt die Beteiligung eines peroxisomalen Membranproteins und cytosolischer Faktor(en) an der Bindung von Peroxisomen an Mikrotubuli vermuten. Dafür spricht auch, daß bestimmte durch Gelfiltration erhaltene Proteinfraktionen des dialysierten KCl-Eluates die Bindung steigerten. Diese Fraktionen sowie isolierte Peroxisomen zeigten eine starke Immunreaktivität einer Polypeptidbande von 70 kDa mit einem Antikörper gegen das cytoplasmatische Linkerprotein (CLIP)-115. Cosedimentationsexperimente mit Mikrotubuli zeigten die Assoziation dieses Polypeptides an Mikrotubuli. Weiterhin vermochte die Immundepletion des KCl-Eluates mit einem Antikörper gegen die konservierte Mikrotubulibindungsdomäne der CLIPs den stimulierenden Effekt auf die Bindung aufzuheben. Somit scheint ein CLIP-ähnliches 70 kDa Polypeptid an der Bindung von Peroxisomen an Mikrotubuli beteiligt zu sein.

Translation of abstract (English)

A semiquantitative in vitro binding assay based on the association of highly purified rat liver peroxisomes to reconstituted microtubules coated onto microtiterplates was developed to characterize the interactions of peroxisomes with microtubules. The specific binding of peroxisomes to microtubules was demonstrated by confocal laser scanning microscopy and negative staining electron microscopy. The binding was concentration dependent and saturable, being affected by incubation time, temperature, and pH. Addition of ATP, kinases, phosphatase inhibitor or motor proteins increased the binding capacity, while ATP-depletion or microtubule associated proteins decreased it. KCl-treatment of peroxisomes reduced the binding, which was restored by dialyzed KCl-stripping-eluate as well as by rat liver cytosol. The reconstituting effect of cytosol was abolished by its pretreatment with proteases or N-ethylmaleimide (NEM). Moreover, the treatment of peroxisomes with proteases or NEM reduced their binding, which was not reversed by cytosol. These results suggest the involvement of a peroxisomal membrane protein and cytosolic factor(s) in the binding of peroxisomes to microtubules. This notion is supported by the observation that distinct subfractions of dialyzed KCl-stripping-eluate obtained by gel-chromatography augmented the binding. Those subfractions, as well as purified peroxisomes, exhibited strong immunoreactivity with an antibody to cytoplasmic linker protein (CLIP)-115, revealing a 70 kDa polypeptide. Cosedimentation experiments with microtubules proved the binding of this polypeptide to microtubules. Moreover, immunodepletion of KCl-stripping-eluate with an antibody to the conserved microtubule binding domain of CLIPs, abolished their promoting effect on the binding. Hence, a CLIP-related 70 kDa polypeptide seems to be involved in the binding of peroxisomes to microtubules.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Fahimi, Prof. Dr. H.Dariush
Date of thesis defense: 19. July 2001
Date Deposited: 14. Sep 2001 00:00
Date: 2001
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut für Anatomie und Zellbiologie
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Peroxisom, Mikrotubulus, Zellskelett
Uncontrolled Keywords: Organellenbindung , Bindungsassay , cytoplasmatische Linkerproteineperoxisome , microtubule , organelle binding , binding assay , cytoplasmic linker protein
Additional Information: Teile in: European Journal of Biochemistry 267, 6264-6275
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