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Secrets to finding the ideal mate: New insights into parameters that govern successful Adeno-associated virus (AAV) vector evolution

Kienle, Eike Christoph

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Abstract

The success of human gene therapy - the treatment of hereditary or acquired diseases with a genetic cause - depends on potent, safe and specific gene delivery vectors. Amongst the large variety of currently available non-viral or viral vectors, those derived from Adeno-associated viruses (AAV) are particularly attractive due to a unique combination of assets: the virus/vector is apathogenic, poses little risk of insertional mutagenesis, has a broad host and cell range, and can easily be modified and produced in large quantities. However, no natural AAV fulfills all the requirements for clinical use in humans, raising a need for new technologies and strategies to engineer synthetic “designer” vectors. Accordingly, the central aim of this work was to improve and apply two fundamental methods for molecular AAV vector evolution, DNA family shuffling and peptide display. The first technology relies on fragmentation and homology-based recombination of capsid genes from closely related AAV serotypes, resulting in libraries of AAV chimeras from which capsids with desired properties can be enriched via subsequent selection. Here, we initially assessed and optimized the key steps for AAV shuffling, culminating in a robust and standardized new protocol for AAV library generation. Next, we used this protocol to shuffle AAV2, 8 and 9, and exploited the resulting library to analyze two major parameters for AAV selection - helper virus and anti-AAV-antibodies. Interestingly, we found that AAV capsids selected in the presence of a helper virus give stronger gene expression, implying that their intracellular processing is enhanced. Moreover, comparative analyses of AAVs isolated under various conditions with human antisera showed that the degree of negative selection pressure determines the balance between infectivity and immunity of the viral particles. Finally, we also performed a helper virus-free in vivo biopanning with a library comprising AAV1, 5, 6, 8 and 9 in murine pancreas. Intriguingly, gene expression from the single clone emerging after three selection rounds was low, supporting our conclusion that the presence of a helper virus is key for potent AAV vector evolution. Unlike shuffling, AAV vector improvement through peptide display starts with a single viral serotype (traditionally AAV2) whose capsid is expanded by insertion of 7-9 aa into an exposed loop, with the aim to alter vector tropism towards desired target cells. Here, we extended this strategy to 11 alternative AAV serotypes and demonstrate their tremendous, previously unrecognized potential as scaffolds for viral peptide display. Therefore, we first implemented a simple PCR protocol for rapid cloning of peptide-encoding sequences into AAV capsid genes, which replaces the original stepwise mutagenesis. We then used our new approach to insert 6 distinct peptides into all 12 AAV serotypes, resulting in a collection of 84 YFP-encoding vectors (12 wildtypes & 72 mutants). While screening this panel in a large array of human and non-human cell lines and primary cells, we made three important observations: i) AAV vector transduction is not determined by the peptide alone but largely depends on the capsid context; ii) alternative AAV serotypes with certain peptides frequently outperform the AAV2 prototype and its peptide derivatives; and iii) some serotype-peptide combinations even allow to transduce cells previously considered refractory to AAV infection. Subsequent analysis of further peptides showed that a common motif, NxxRxxx, is enriched in the best performing candidates and particularly enhances AAV1, 7-9 and rh.10. Based on these findings, we assembled a “Master panel” of vectors including the superior serotype-peptide combinations from our various screens, and used it in collaborative studies to select potent new AAV vectors in clinically relevant cell types, such as myeloid cell lines, primary human myeloma cells, or dorsal root ganglia and proprioceptive neurons. As a whole, the work in this thesis makes a number of essential contributions to the fields of AAV biology, AAV vector development and human gene therapy. First, it resulted in optimized protocols and tools that substantially simplify, standardize and accelerate the future generation of tailored AAV capsids for vector engineering. Second, it also yielded a wide variety of new AAV variants - either in the form of shuffled libraries or as panels of specific capsid-peptide combinations - that can now be screened in further cell lines, primary cells or even directly in vivo. Third, the data obtained in this thesis with the various wildtype, shuffled or peptide-modified capsids greatly improve our knowledge of fundamental steps in cellular AAV infection. Most importantly, our results consistently exemplify that the function of AAV capsids is not determined by single residues, but rather results from very complex interactions of different regions that are dispersed throughout the viral shell. Altogether, the present thesis fuels the belief that AAV is one of the most versatile, powerful and robust viral vector systems available today and that it provides unique benefits for clinical translation in humans.

Translation of abstract (German)

Der Erfolg humaner Gentherapie - die Behandlung angeborener oder erworbener Erkrankungen mit genetischen Ursachen - hängt ab von wirksamen, sicheren und spezifischen Vektoren zum Transport von „fremdem“ genetischem Material. Unter den gegenwärtig verfügbaren nicht-viralen und viralen Vektoren erweisen sich solche basierend auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) dank einer einzigartigen Kombination günstiger Eigenschaften als besonders attraktiv: Virus und Vektor sind apathogen, haben ein geringes Risiko für Mutationen durch Integration, zeigen ein breites Wirtszell-Spektrum, sind leicht modifizierbar und in großem Maßstab produzierbar. Allerdings erfüllt kein natürlich vorkommendes AAV alle Bedingungen für die klinische Anwendung im Menschen, weshalb neue Technologien und Strategien für die Entwicklung synthetischer „Designer“- Vektoren notwendig sind. Zentrales Ziel dieser Arbeit war demgemäß die Optimierung und Anwendung zweier prinzipieller Methoden zur molekularen AAV-Vektor-Evolution, „DNA-Family-Shuffling“ und „Peptid-Display“. Die erste Technologie basiert auf der Fragmentierung und homologen Rekombination von Kapsidgenen verwandter AAV-Serotypen, gefolgt von der Selektion von Kapsiden mit gewünschten Eigenschaften aus den resultierenden Bibliotheken chimärer AAVs. In dieser Arbeit wurden zunächst die wichtigsten Schritte des Shuffling-Prozesses ermittelt und optimiert, um basierend darauf ein neues, robustes und standardisiertes Protokoll festzulegen. Nach dessen Verwendung zum „Shuffling“ der Serotypen AAV2, 8 und 9 wurden anhand der erzeugten Bibliothek zwei wichtige Aspekte der AAV-Selektion studiert - Helfervirus und anti-AAV-Antikörper. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass in Anwesenheit des Helfervirus selektierte AAV-Kapside eine stärkere Genexpression vermitteln, was auf bessere intrazelluläre Prozessierung hinweist. Weiterhin zeigte die vergleichende Untersuchung von AAV-Isolaten nach Selektion unter verschiedenen Bedingungen in Anwesenheit von humanem Antiserum, dass das Ausmaß des negativen Selektionsdrucks das Verhältnis zwischen Infektiösität und Immunogenität bestimmt. Abschließend wurde eine Bibliothek aus den Serotypen AAV1, 5, 6, 8 und 9 in Abwesenheit von Helferviren im Pankreas von Mäusen selektioniert. Überraschenderweise zeigte der nach drei Selektionsrunden angereicherte Klon eine geringe Expression, was unsere These unterstützt, dass eine erfolgreiche AAV-Vektor-Evolution die Anwesenheit von Helferviren erfordert. Anders als beim Shuffling startet die AAV-Vektor-Optimierung durch Peptid-Display mit nur einem Serotyp (meist AAV2), dessen Kapsid durch den Einbau von 7-9 Aminosäuren in eine exponierte Region verändert wird. Ziel ist dabei die Anpassung des Vektor-Tropismus an einen gewünschten Zelltyp. Diese Strategie wurde hier auf 11 weitere Serotypen erweitert, was zur Entdeckung ihres enormen, bisher unbeachteten Potenzials als Gerüst für Peptid-Display geführt hat. Hierzu wurde zuerst ein PCR-Protokoll etabliert, das die schnelle und einfache Klonierung Peptid-kodierender Sequenzen in AAV-Kapsidgene ermöglicht und das die bisherige schrittweise Mutagenese-Strategie ersetzt. Dieser Ansatz wurde nachfolgend zum Einbau von sechs definierten Peptiden in alle 12 AAV-Serotypen verwendet, was zu einer Kollektion von 84 YFP-kodierenden Vektoren geführt hat (12 Wildtypen & 72 Mutanten). Das ‘Screening‘ dieser Kollektion auf einer Vielzahl humaner und nicht-humaner Zelllinien und primären Zellen ergab drei wichtige Befunde: i) AAV-Vektor-Transduktion wird nicht nur durch das Peptid bestimmt, sondern hängt stark vom Kapsid-Kontext ab; ii) alternative Serotypen mit bestimmten Peptiden übertreffen häufig den AAV2-Prototyp und davon abgeleitete Derivate; und iii) einige Serotyp-Peptid-Kombinationen erlauben sogar die Transduktion von Zellen, die bisher als resistent gegenüber AAV galten. Die Analyse dieser und weiterer Peptide führte zur Identifikation des Motivs NxxRxxx, das in den effizientesten Peptiden angereichert ist und besonders AAV1, 7-9 und rh.10 verbessert. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde ein ‘Master Panel‘ (MP) erstellt, welches die besten Serotyp-Peptid-Kombinationen aus den verschiedenen Screens umfasst. Dieses MP wurde in Kooperation mit anderen Gruppen verwendet, um potente neue AAV-Vektoren in diversen klinisch relevanten Zellen zu identifizieren, darunter myeloide Zelllinien, primäre humane Myelomzellen, sowie neuronale Zellen der dorsalen Wurzelganglien und propriozeptive Neuronen. Zusammengefasst leistet die vorliegende Arbeit wichtige Beiträge für das Feld der AAV-Biologie, der AAV-Vektor-Entwicklung und der humanen Gentherapie. Erstens erlauben die optimierten Protokolle und Konstrukte künftig die einfachere, standardisierte und rapidere Generierung maßgeschneiderter AAV-Vektoren. Zweitens erbrachte die Arbeit vielfältige neue AAV-Varianten - in Form chimärer Bibliotheken oder spezieller Kapsid-Peptid-Kombinationen - die nun in weiteren Zelllinien, primären Zellen oder in vivo getestet werden können. Drittens haben die in dieser Arbeit mit verschiedenen natürlichen, chimären oder Peptid-modifizierten AAV-Kapsiden erzielten Daten unser Verständnis fundamentaler Schritte der zellulären AAV-Infektion erweitert. Eine zentrale Erkenntnis war, dass die Funktion von AAV-Kapsiden nicht durch einzelne Aminosäuren bestimmt wird, sondern durch komplexe Interaktionen verschiedener verteilter Regionen. Insgesamt unterstützt die vorliegende Arbeit die Ansicht, dass AAV eines der vielseitigsten, leistungsfähigsten und robustesten viralen Vektor-Systeme ist, welches einzigartige Vorteile für die klinische Anwendung im Menschen bietet.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kräusslich, Prof. Dr. Hans-Georg
Date of thesis defense: 13 November 2014
Date Deposited: 18 Dec 2014 07:02
Date: 2014
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
600 Technology (Applied sciences)
Uncontrolled Keywords: AAV
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