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Nug1 is a potassium-stimulated GTPase affecting the association of early 60S assembly factors in ribosome biogenesis

Manikas, Rizos-Georgios

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Abstract

Ribosomes are complex macromolecular machineries responsible for protein synthesis (translation) in all living cells. In yeast, they are composed of four rRNA species assembled with 79 ribosomal proteins to form the small (40S) and the large (60S) subunit. To reach their final translation-competent form, they go through a complex, highly dynamic and coordinated process termed ribosome biogenesis. In eukaryotes, more than 180 transiently associating non-ribosomal factors (assembly factors) and 70 small nucleolar RNAs (snoRNAs) are involved in rRNA processing and modifications, as well as in the assembly of r-proteins (Henras et al., 2008; Lafontaine and Tollervey, 2001; Staley and Woolford, 2009). Several of the 60S ribosome biogenesis factors belong to the superfamily of GTPases, including Nug1. Nug1 is a circularly permuted GTPase and an essential trans-acting factor in ribosome biogenesis. It co-purifies with various nucleolar and nucleoplasmic pre-ribosomal particles and exhibits RNA-binding properties (Bassler et al., 2001; Bassler et al., 2006). However, several questions remained open regarding the exact role of Nug1 in ribosome biogenesis, including the regulation of its enzymatic GTPase activity, its binding site on the pre-ribosome, as well as a possible role in the recruitment and/or release of other 60S assembly factors. During my PhD studies, I performed a series of in vitro GTPase and nucleotide binding assays using the C. thermophilum (CtNug1) orthologue to address Nug1’s enzymatic activity. With these, I showed that CtNug1 exhibits a low intrinsic GTPase activity that can be stimulated by potassium ions, rendering Nug1 a cation-dependent GTPase. I’ve also generated a series of point mutations in the G-domain that specifically inhibit GTP hydrolysis or nucleotide binding. The orthologous mutations in the yeast Nug1 GTPase domain were subsequently tested for their effects on ribosome biogenesis. Early 60S assembly factors including Dbp10, Spb1, Nop2 and Mrt4 associated less with affinity purified pre-ribosomal particles, when the Nug1 nucleotide-binding mutant (D446N) was expressed or when Nug1 was depleted. Interestingly, no growth defects or biochemical differences in pre-ribosomal particle composition were observed for the catalytic (G339A) mutant, suggesting that the GTP hydrolysis is not essential for Nug1’s function. From the early assembly factors affected, only the essential RNA helicase Dbp10 was genetically linked to Nug1 (Bassler et al., 2001). In collaboration with Dr. Emma Thomson, we identified the binding sites of Nug1 and Dbp10 onto the pre-ribosome using the CRAC technique. Both proteins were found to bind in close proximity to each other on the interface of the 60S subunit at the PTC area. Further, in vitro binding assays confirmed a physical interaction between Nug1 and Dbp10. Together the findings from my PhD thesis show that Nug1 affects the dynamic interplay of assembly factors including those localizing to the PTC area (Dbp10, Sbp1, Nop2, Nsa2), as well as factors involved in the P-stalk formation (Mrt4, Yvh1, Rpp0, Rpl12). In this interplay, the Nug1 binds at the base of helix 89 and may act as a molecular GTPase switch that mediates the crosstalk between the maturation of PTC and the P-stalk, two distinct and essential hallmarks of the 60S subunit.

Translation of abstract (German)

Ribosomen sind komplexe makromolekulare Maschinen, die für die Proteinbiosynthese (Translation) in allen lebenden Zellen zuständig sind. Die Ribosomen der Hefe setzen sich aus vier RNA-Spezies und 79 ribosomalen Proteinen zusammen, welche die kleine (40S) und große (60S) Untereinheit formen. Um ihre endgültige, translationskompetente Form anzunehmen, müssen sie einen komplexen, hochdynamischen und streng koordinierten Prozess durchlaufen, der Ribosomenbiogenese genannt wird. In Eukaryoten sind mehr als 180 vorübergehend assoziierte, nicht-ribosomale Faktoren (Assemblierungsfaktoren) und 70 small nucleolar RNAs (snoRNAs) an der Weiterverarbeitung und Modifizierung von rRNAs sowie an der Assemblierung von r-Proteinen beteiligt. Mehrere 60S Biogenesefaktoren gehören zur Superfamilie der GTPasen – so auch Nug1. Nug1 ist eine zyklisch permutierte GTPase und ein essentieller trans-wirkender Faktor der Ribosomenbiogenese. Es wird mit verschiedenen nukleolären und nukleoplasmischen prä-ribosomalen Partikeln co-aufgereinigt und verfügt über RNA-bindende Eigenschaften. Mehrere Fragen bezüglich der genauen Rolle von Nug1 in der Ribosomenbiogenese blieben bisher jedoch unbeantwortet, darunter die Regulierung der enzymatischen GTPase Aktivität, die Bindestelle auf dem Prä-Ribosom und eine mögliche Rolle in der Rekrutierung und/oder der Freisetzung von anderen 60S Assemblierungsfaktoren. In meiner Doktorarbeit habe ich eine Reihe von in vitro GTPase- und Nukleotid-Bindeassays mit dem C. thermophilum Nug1 Ortholog (CtNug1) durchgeführt, um die enzymatische Aktivität von Nug1 zu untersuchen. Mit diesen Studien konnte ich zeigen, dass CtNug1 über eine geringe intrinsische GTPase-Aktivität verfügt, die von Kaliumionen stimuliert wird; d.h. Nug1 ist eine Kationen-abhängige GTPase. Ich habe außerdem eine Reihe von Punktmutationen in der G-Domäne generiert, die spezifisch die GTP Hydrolyse oder die Nukleotidbindung inhibieren. Anschließend wurden die orthologen Mutationen in der GTPase-Domäne von Hefe Nug1 erzeugt und ihre Auswirkungen auf die Ribosomenbiogenese untersucht. Frühe Assemblierungsfaktoren wie Dbp10, Spb1 und Mrt4 sind mit geringerer Affinität an aufgereinigte prä-ribosomale Partikel assoziiert, wenn die Nukleotid-binde-Mutante (D446N) von Nug1 exprimiert wird oder wenn Nug1 zuvor abgereichert wurde. Für die katalytische Mutante (G339A) konnten jedoch keine Wachstumsdefekte oder biochemische Unterschiede in der Zusammensetzung der prä-ribosomalen Partikel gefunden werden. Dies spricht dafür, dass die GTP Hydrolyse für die Funktion von Nug1 nicht essentiell ist. Von den betroffenen frühen Assemblierungsfaktoren ist nur die essentielle RNA-Helikase Dbp10 genetisch mit Nug1 gekoppelt. In Kollaboration mit Dr. Emma Thomson konnten wir mit Hilfe des CRAC Verfahrens die Bindestellen von Nug1 und Dbp10 am Prä-Ribosom identifizieren. Beide Proteine befinden sich nahe beieinander an der Schnittstelle der 60S Untereinheit im Bereich des PTCs. In vitro Bindeassays bestätigten eine physikalische Interaktion zwischen Nug1 und Dbp10. Zusammen zeigen die Ergebnisse meiner Doktorarbeit, dass Nug1 das dynamische Zusammenspiel der Assemblierungsfaktoren, inklusive der PTC-lokalisierten Faktoren (Dbp10, Sbp1, Nop2, Nsa2) und derjenigen, die an der Ausbildung des P-Stalks beteiligt sind (Mrt4, Yvh1, Rpp0, Rpl12), beeinflusst. In diesem Wechselspiel bindet Nug1 and die Basis von Helix 89 und kann als molekularer GTPase Schalter wirken, der im Dialog der Entstehung von PTC und P-Stalk vermittelt, zweier ausgeprägter und essentieller Merkmale der 60S Untereinheit.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hurt, Prof. Dr. Ed C.
Date of thesis defense: 18 December 2014
Date Deposited: 16 Jan 2015 10:52
Date: 2014
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 000 Generalities, Science
500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
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