English Title: The GTPase Dynamin A : structural and biochemical evidences for a molecular motor

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Abstract

Die GTPasen der Dynamin-Familie besitzen eine einheitliche Domänenstruktur, erfüllen aber sehr unterschiedliche biologische Funktionen, wie die Vesikelgenerierung in der Endocytose, den Erhalt der Mitochondrienmorphologie und die Abwehr von viralen Pathogenen. Während die biologische Funktion zumeist das Abschnüren von Lipidmembranen zu beinhalten scheint, ist der Mechanismus, nach dem Dynamine diese Funktion erfüllen, ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein Dynamin A aus dem eukaryotischen Modellorganismus Dictyostelium discoideum (Sozialamöbe) verwendet, um den Mechanismus der Dynamine zu untersuchen. Nach der Optimierung der Reinigung von Dynamin A aus D. discoideum konnte mit Hilfe der Elektronenmikroskopie gezeigt werden, daß Dynamin A zu Ringen assembliert, die denen von humanem Dynamin 1 stark ähneln. Aus den elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden Projektionen der Aufsicht und der Seitenansicht des nukleotidfreien Dynamin A Ringkomplex erstellt und daraus die dreidimensionale Struktur des Ringkomplexes berechnet. Diese Struktur erlaubt erstmals Einblicke in die molekulare Organisation von assemblierten Dynaminen. Der Dynamin A Ringkomplex besteht aus 22 Monomeren, die sich in zwei Lagen zu jeweils zwei konzentrischen Ringen mit 11-facher Rotationssymmetrie anordnen. An der Innenseite des inneren Rings befinden sich spitze Strukturen, die ideal positioniert sind, um eine umwickelte Lipidmembran zu perforieren. Die elektronenmikroskopische Analyse der nukleotidabhängigen Konformationsänderungen zeigte, daß Dyanmin A bei Bindung eines schwer-hydrolysierbaren GTP-Analogs zu Filamenten assembliert. Der nukleotidfreie Ringkomplex reorganisiert sich dabei zu einer Spirale und verkleinert seinen Durchmesser um 20 Dies ist der direkte Nachweis, daß der Ringkomplex nukleotidabhängig kontrahiert und daß diese Kontraktion bereits bei GTP-Bindung erfolgt. Damit ist Dynamin A prinzipiell in der Lage, auf eine umwickelte Lipidmembran Kraft auszuüb

Translation of abstract (English)

Dynamins are high molecular weight GTPases involved in membrane severing processes including endocytosis and mitochondrial division. Human dynamin 1 can self-assemble into rings and spirals around lipid structures and is thought to sever them in a GTP-dependent manner. However, neither the structure of these ring complexes is known nor is the mechanism of force generation understood. The lower eucaryote Dictyostelium discoideum has two dynamin-like proteins, of which dynamin A has been shown to be functionally similar to dynamin 1. In particular, dynamin A forms rings and spirals that are very similar to those of dynamin 1. We used transmission electron microsopy and subsequent single particle analysis to elucidate the structure of the dynamin A ring complex. We analysed the rings in different nucleotide states to gain insight into the mechanism of proposed force generation. Here we present the three dimensional reconstruction map of the dynamin A ring complex in the nucleotide free state. The complex reveals an 11-fold symmetry and consists of two concentric rings. From this structure, the domain organisation within the asymmetric unit is proposed. In addition, structural changes induced by the nucleotide state of dynamin A are reported.