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Etablierung eines organotypischen Hautmodells zur Rolle der humanen epidermalen Stammzellen in der Wundheilung in vitro

Scholz, Philipp Andreas

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PDF, German
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Abstract

Die Wundheilung ist eine essentielle Fähigkeit der menschlichen Haut. Reepithelialisierung ist der Teilprozess der Wundheilung, bei dem die Barrierefunktion nach einer Verletzung wieder hergestellt wird. Hierbei spielen infollikuläre Epidermale Stammzellen (IES) eine entscheidende, aber wenig untersuchte Rolle. Pathologische Störungen der Wundheilung beeinträchtigen Millionen Menschen allein in Deutschland. Daher ist ein großer Bedarf für verbesserte Therapiemöglichkeiten vorhanden. Grundlage für die Entwicklung von therapeutischen Strategien ist ein vertieftes Verständnis der Regulationsvorgänge des Reepithelialisierungsprozesses. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, auf Basis gerüstverstärkter organotypischer Kokulturen (scaOTCs) ein verbessertes in vitro-Modell der menschlichen Reepithelialisierung zu etablieren, welches die Analyse der Genexpression und die Darstellung der IES während der Reepithelialisierung erlaubt. Die physiologische Relevanz des Wundheilungsmodells mit deutlich verlängerter Kultivierbarkeit wurde zunächst anhand der Expression bekannter Wundheilungsmarker untersucht und bestätigt. Imunhistochemisch wurde die transiente und räumlich begrenzte Expression von u. a. Keratin 17 und Vimentin in Übereinstimmung mit der Wundsituation in vivo gezeigt. Die Auswirkungen grundlegender Parameter der Kulturbedingungen wurden untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass eine längere Kultivierungszeit vor Verwundung die Wundheilungsrate senkt, bzw. die Zeitspanne bis zum Einsetzen der Reepithelialisierung erhöht. Dies ist vermutlich durch den mit zunehmender Reife des Epithels sinkenden Aktivierungsgrad bedingt. Daneben wirkt sich die Verfügbarkeit von Signalmolekülen in Form von Serum-Supplementation drastisch auf die Lebensdauer und die Heilungsfähigkeit verwundeter OTCs aus. IES können aufgrund fehlender Markerproteine nur als label-retaining cells (LRCs) detektiert werden. Die zur Generierung von LRCs durch pulse-chase-Markierung erforderlichen Kultivierungszeiten konnten in dieser Arbeit erstmals in einem derartigen Wundmodell gewährleistet werden. Der Anteil der LRCs stieg während der Reepithelialisierung von etwa 5% auf bis zu 20%, während der Anteil im intakten, wundfernen Epithel über den untersuchten Zeitraum konstant blieb. Dies lässt auf eine selektiv verstärkte Migration von LRCs in den Wundbereich schließen. Durch globale Genexpressionsanalysen wurde die Genregulation der Epidermis während der Reepithelialisierung untersucht. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass bekannte Regulationsmuster der Wundheilung auch im Modell auftreten, obwohl hier die Regulation nur zwischen Keratinozyten und Fibroblasten und unter Ausschluss von Zellen der Blutbahn, bzw. autokrin stattfinden kann. Entzündungsfördernde Regulationswege, vermittelt durch Interleukin-1 und TNF standen im frühen Stadium der Reepithelialisierung im Vordergrund. Diese leiten vermutlich weitere, durch Wachstumsfaktoren vermittelte Signalkaskaden, sowie weitreichende Umbauten des Zytoskeletts ein. Es konnte gezeigt werden, dass diese tiefgreifenden Veränderungen reversibel waren und nach erfolgtem Wundschluss eine Annäherung an den Ausgangszustand erfolgte. Die Ergebnisse zeigen, dass das etablierte Langzeit-Wundmodell im Gegensatz zu bisherigen in vitro-Modellen die Beobachtung der Reepithelialisierung von der Epithelreaktivierung durch die Verwundung bis zur Wiederherstellung der Homöostase erlaubt. Darüber hinaus eröffnet es die Möglichkeit zur Untersuchung von IES als LRCs, was mit bisherigen Modellen aufgrund der deutlich kürzeren Lebensdauer nicht möglich ist. Die Genexpressionsanalyse bietet wichtige Daten zur auto- und parakrinen Regulation der Keratinozyten.

Translation of abstract (English)

Wound healing is an essential feature of human skin. Re-epithelialisation is the aspect of wound healing that re-establishes the barrier function of the skin after mechanical, chemical or biological disruption of the skin barrier. Interfollicular epidermal stem cells (IES) play a crucial, yet under-investigated role during this process. Millions of patients are affected by pathologic wound healing disorders in Germany, making novel treatment strategies indispensable. The development of these strategies in turn demands deeper insights into the complex concerted regulatory processes during re-epithelialisation. Therefore, the aim of this thesis was the development of an improved in vitro model of human skin wound healing, which would provide most physiological conditions for the investigation of IES contribution and the analysis of gene regulation during re-epithelialisation. The physiologic relevance of the novel wound healing model is connected to the significantly prolonged cultivation period. It was first tested by fluorescence staining for well established marker proteins like Keratin 17 and vimentin, confirming that marker expression reflected the in vivo situation. Effects of vital culture conditions were investigated. It was shown that prolonged pre-cultivation resulted in extended lag-period before onset of re-epithelialisation and reduced the rate of wound healing. This is presumably caused by reduced levels of keratinocyte activation in largely homeostatic epithelia. Furthermore, the availability of signal molecules like growth factors by serum supplementation significantly affected the wound healing rate and the life span of the model system. Due to the lack of reliable marker proteins, IES can only be visualized by pulse-chase labelling and consequent label-retention. A significantly extended life span is essential for the generation of labe-retaining cells (LRCs) and was achieved for the first time in an in vitro wound healing model. Wound healing studies revealed the dynamics of the LRCs population during re-epithelialisation. The proportion of LRCs increased from 5% up to 20% during re-epithelialisation, while the proportion was stable in the distal part of the epithelium, pointing towards selectively enhanced migration of LRCs into the wound area. Global gene expression analysis of keratinocytes during wound healing was performed. The results showed well-established patterns of gene regulation associated with wound healing. These complex patterns were cause only by autocrine regulation or keratinocyte-fibroblast interaction, as the model system is devoid of blood-derived cells. Interleukin-1 and TNF-mediated inflammatory pathways were strongly upregulated in the early migratory stage of re-epithelialisation, pointing to an initiating function for further signalling cascades and profound cytoskeleton remodelling. It was shown that these far-reaching changes were widely reverted after wound closure. In contrast to previously published wound healing models, this novel long-term model of human skin wound healing allows the investigation of the wound healing process from epithelial activation through re-epithelialisation to re-established homeostasis. In addition potential interfollicular stem cells can be observed as LRCs in the context of wound healing for the first time. The gene expression data prove the relevance of the model system and provide valuable insights into the auto- and paracrine regulation of keratinocyte dynamics.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Angel, Prof. Dr. Peter
Date of thesis defense: 22 February 2016
Date Deposited: 26 Feb 2016 09:57
Date: 2016
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
610 Medical sciences Medicine
Controlled Keywords: Zellkultur, Gewebekultur, tissue engineering, Wundheilung
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