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HIGHGLY EFFICIENT ACTIVATION AND EXPANSION OF NATURAL KILLER CELLS FOR CLINICAL USE IN CANCER IMMUNOTHERAPY

Granzin, Markus

German Title: Hocheffiziente Aktivierung und Expansion von natürlichen Killerzellen für den klinischen Einsatz in der Krebsimmuntherapie

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Abstract

Natural killer (NK) cells can detect and kill tumor cells and infusion of NK cells to cancer patients may be a promising option to treat cancer. In this context, ex vivo expansion is used to produce large quantities of activated NK cells, because sufficient numbers of these effector cells are essential for successful NK cell based adoptive cancer immunotherapy. The development of efficient NK cell expansion protocols and the transfer of these protocols to clinically applicable methods represent a major challenge. To overcome this issue, the aim of my project was to develop a clinically applicable method that yields large numbers of highly functional NK cells. First, a fully automated technical process was developed to activate and expand NK cells with (interleukin) IL-2 and irradiated clinical-grade feeder cells (EBV-LCL). In comparison to the manual procedure, the automated process yielded similar NK cells in terms of cell numbers, surface marker profile, gene expression and in vitro effector functions. Upon expansion, NK cells up-regulated functional surface molecules, such as TRAIL, FasL, NKG2D and DNAM-1, they increased the production of interferon (IFN)-g and tumor necrosis factor (TNF)-a and they became more cytotoxic against tumor cell lines. Next, because in the used protocol NK cell expansion was restricted to a period of 2-4 weeks, a more efficient protocol for long-term expansion was developed. Manual NK cell expansion with EBV-LCL and IL-2 induced a 22– fold mean NK cell expansion after one week that was significantly increased to 53–fold by addition of IL-21. Furthermore, repeated stimulation with irradiated EBV-LCL and IL-2 and addition of IL-21 at the initiation of the culture allowed sustained NK cell proliferation with 1011–fold NK cell expansion after six weeks, which is an unprecedented high expansion rate not achieved by any other method so far. Most importantly, adoptive transfer of NK cells expanded with this optimized protocol led to significant inhibition of tumor growth in a melanoma xenograft mouse model, proofing the therapeutic efficacy of the ex vivo generated NK cells. This anti-tumor efficacy was superior over that from conventionally IL-2 activated NK cells, demonstrating that the improved NK cell expansion method enhanced not only the quantity but also the therapeutic quality of NK cells. In conclusion, the outcome of this project is a fully automated process for ex vivo production of NK cells and an optimized protocol for NK cell expansion with unparalleled efficacy. The expanded NK cells possess potent anti-tumor features and showed therapeutic efficacy in a preclinical melanoma xenograft model. Thereby, the project serves clinical needs and makes it possible to generate high cell doses of functional NK cells for the use in cancer immunotherapy.

Translation of abstract (German)

Natürliche Killer (NK) Zellen können Tumorzellen erkennen und zerstören und die Behandlung von Krebspatienten mit NK Zellen stellt eine mögliche Option der Krebstherapie dar. In diesem Zusammenhang wird die ex vivo Expansion genutzt, um große Mengen an aktivierten NK Zellen herzustellen, denn eine ausreichende Zahl dieser Effektorzellen ist essentiell für eine erfolgreiche NK Zell basierte adoptive Krebsimmuntherapie. Jedoch stellen die Entwicklung effizienter Protokolle für die NK Zell Expansion und der Transfer dieser Protokolle in klinisch anwendbare Methoden eine große Herausforderung dar. Daher war das Ziel meines Projekts die Entwicklung einer klinisch anwendbaren Methode, die große Mengen an hochfunktionellen NK Zellen hervorbringt. Zuerst wurde ein vollautomatisierter technischer Prozess entwickelt für die Aktivierung und Expansion von NK Zellen mit Interleukin(IL)-2 und bestrahlten Feederzellen mit klinischer Qualität (EBV-LCL). Im Vergleich zur manuellen Prozedur lieferte der automatisierte Prozess ähnliche NK Zellen in Bezug auf die Zellzahlen, das Profil von Oberflächenmarkern, die Genexpression und die in vitro Effektorfunktion. Durch die Expansion hatten die NK Zellen funktionelle Oberflächenmoleküle hochreguliert, wie z.B. TRAIL, FasL, NKG2D und DNAM-1, sie erhöhten die Produktion von Interferon (IFN)-g und Tumornekrosefaktor (TNF)- a und wurden zytotoxischer gegenüber Tumorzelllinien. Weil die NK Zell Expansion bei dem verwendeten Protokoll auf eine Dauer von 2-4 Wochen beschränkt war, wurde als nächstes ein effektiveres Protokoll für die Langzeitexpansion entwickelt. Die manuelle NK Zell Expansion mit EBV-LCL und IL-2 induzierte im Mittel nach einer Woche eine 22-fache NK Zell Expansion, welche durch die Zugabe von IL-21 deutlich auf eine 55-fache NK Zell Expansion erhöht wurde. Außerdem ermöglichte die wiederholte Stimulation mit EBV-LCL und IL-2 und die Zugabe von IL-21 zu Beginn der Kultur eine anhaltende NK Zell Proliferation mit 1011- facher NK Expansion nach sechs Wochen, was eine einmalig hohe Expansionsrate darstellt, die durch andere Methoden bisher nicht erreicht wird. Am wichtigsten jedoch war, dass der adoptive Transfer von NK Zellen, die mit dem optimierten Protokoll expandiert wurden, zur Inhibierung des Tumorwachstums in einem Melanom Xenotransplantat Mausmodell führte, wodurch die therapeutische Wirksamkeit der ex vivo generierten NK Zellen nachgewiesen wurde. Dieser therapeutische Effekt war deutlicher ausgeprägt als bei konventionell mit IL-2 aktivierten NK Zellen und zeigt, dass die optimierte Methode für die NK Zellexpansion nicht nur die Quantität sondern auch die therapeutische Qualität der NK Zellen erhöht. Zusammenfassung VI Zusammenfassend ist das Resultat dieses Projekts ein vollautomatisierter Prozess zur ex vivo Produktion von NK Zellen und ein optimiertes Protokoll für die NK Zellexpansion mit beispielloser Effektivität. Die expandierten NK Zellen besitzen Eigenschaften für eine wirksame Krebsbekämpfung und sie zeigten therapeutische Wirksamkeit in einem präklinischen Melanom Xenotransplantat Mausmodell. Damit dient das Projekt klinischen Anforderungen und macht es möglich hohe Dosen an funktionellen NK Zellen zu generieren für den Einsatz in der Krebsimmuntherapie.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Umansky, Prof. Dr. Viktor
Date of thesis defense: 25 April 2016
Date Deposited: 04 May 2016 11:15
Date: 2016
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
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