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Synthese modularer chemischer Schalter für die optische Mikro- und Nanoskopie

Brox, Dominik

English Title: Synthesis of modular chemical Switches for optical micro- and nanoscopy

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PDF, German
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Abstract

Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein elementares Werkzeug zur Untersuchung molekularer Vorgange auf der Nanometerskala, das sich in den Lebenswissenschaften breit etabliert hat. Durch spektrale Separation können mehrere mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Proteine verfolgt und ihre Interaktionen untereinander sogar in lebenden Zellen aufgeklärt werden. Limitiert wird dies jedoch durch Beugungseffekte, die die Auflösung optischer Abbildungen auf etwa 200nm begrenzt, sowie durch chromatische Aberrationen, welche eine Korrelation verschiedener Strukturen bei Verwendung mehrerer Farbkanäle erschwert. Mit Hilfe molekularer Fluoreszenzschalter können beide Limitationen zugleich überwunden werden: durch chemisch induziertes Einzelmolekülblinken für die Lokalisationsmikroskopie (Chiron - Chemically Improved Resolution for Optical Nanoscopy) und chemisches Multiplexing (ChemPlexing) zur monochromatischen Abbildung mehrerer Strukturen. Als Vorarbeit wurden modulare chemische Schalter entwickelt, die basierend auf einem DNA-Doppelstrang einen Liganden in räumliche Nahe eines Farbstoffs bringen und durch Cu2+-Koordination reversibel in ihrer Emission geschaltet werden können. Die Fluoreszenzlöschung erfolgt dabei durch einen photoinduzierten Elektronentransfer. Durch Variation von Ligand und Farbstoff wurden neue Verbindungen mit höherer Affinität, geringerer Restfluoreszenz im gelöschten Zustand und einer höheren Photostabilität erhalten. In Lokalisationsexperimenten konnte das chemisch induzierte Blinken einzelner Moleküle ausgenutzt werden, um eine Auflösung von rund 90nm zu erreichen. Zudem wurde das chemische Multiplexing als Methode zur Abbildung mehrerer Strukturen in einem Farbkanal etabliert. Durch Kombination herkömmlicher Immunfluoreszenz mit chemischen Schaltern konnten so bis zu vier Strukturen in einer Probe in zwei spektralen Kanälen sequentiell abgebildet werden. Des Weiteren wurden die Grenzen der Methode ausgetestet und auch ihre Anwendbarkeit in der hochauflösenden STED-Mikroskopie demonstriert. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden darüber hinaus neue, auf den Aminosäuren Lysin und 3-Amino-Alanin basierende chemische Schalter mit Dipicolylamin als Ligand entwickelt. Um diese für eine breite Nutzung zugänglich zu machen wurden verschiedene Funktionalitäten (Propargyl-Gruppe, Biotin, (Methyl)-Tetrazin, Halogenalkan, Benzylguanin) verwendet. Am überzeugendsten zeigte sich dabei die Kombination aus Propyl-Atto565 und Biotin-Linker an Dipicolyl-Alanin mit einer Komplexbildungskonstante für Cu2+ von (3.03 +- 0.61) 10^7 L/mol und eine sehr niedrige Restfluoreszenz des gelöschten Zustands von (0.9 +- 0.1) %. In Lokalisationsexperimenten an markierten Mikrotubuli in NIH 3T3 Zellen konnte eine Auflösung von (89 +- 14) nm erreicht werden. Auch beim chemische Multiplexing, sowohl im konfokalen als auch im STED-Mikroskop, konnte eine Auflösung von etwa 90nm in beiden Kanälen demonstriert werden. Das eingeführte Halogenalkan-Derivat als Substrat für das enzymatische Halo-Tag lieferte ebenso gute Ergebnisse wie die Derivate mit Tetrazin- und Methyl-Tetrazin-Funktionalität zur Markierung mittels Kupfer-freier Click-Reaktion. Damit eröffnen sich für die chemischen Schalter vielfältige Methoden zur Markierung, die nun theoretisch auch in lebenden genetisch veränderten Zellen durchführbar sind.

Translation of abstract (English)

Fluorescence microscopy is a well established tool in the life sciences to study molecular processes at microscopic scales. Multiple fluorescently labeled target proteins can be observed and specific interactions can be investigated using separated spectral channels. However, the optical resolution is limited by diffraction to about 200nm and chromatic aberrations prevent the direct correlation of multiple spectral channels. Molecular fluorescent chemosensors present a way to circumvent both limitations. Chemically induced single-molecule blinking can be used for localization microscopy (Chiron - chemically improved resolution for optical nanoscopy), while chemical multiplexing microscopy (ChemPlexing) allows for aberration-free monochromatic imaging of multiple labels. The preliminary chemical switches investigated in this work were based on a DNA duplex that brings a ligand moity and a fluorescent dye in close proximity. Reversible complexation of Cu2+ ions quenches the fluorescence via a photoinduced electron transfer mechanism. The variation of ligand and dye yielded in new probes showing higher affinity, a lowered residual fluorescence in the quenched state and an increased photostability compared to the previously established dye TMR. The localization of single blinking probe molecules on microtubule in fixed HeLa cells achieved a resolution of 90 nm. The chemical multiplexing was established as a technique to sequentially image different structures without chromatic aberrations. By combining standard immunofluorescence labeling with chemical switches up to four different structures in two color channels could be imaged. Besides exploring the limitations of this approach its feasibility with other super-resolution microscopy techniques like STED was also demonstrated. Based on these findings a new generation of the modular chemical switches was created by implementing dipicolylamine as a ligand moity in lysine and 3-aminoalanine. A broad applicability was achieved though different functionalities (propargyl, biotin, (methyl-)tetrazine, halogenated alkane, benzylguanine) that were incorporated in the amino acid based switches. The best results were obtained by combining the dye Propyl-Atto565 and a biotin linker with the dipicolylalanine, showing a complexation constant for Cu2+ of (3.03 +- 0.61) 10^7 L/mol and a very low residual fluorescence in the quenched state of (0.9 +- 0.1) %. Localization experiments on microtubuli in fixed NIH 3T3 cells yielded a resolution of (89 +- 14) nm. The combination of chemical multiplexing and STED microscopy resulted in a resolution of 90 nm in both virtual color channels. Both the haloalkane derivatives–substrates for the enzymatic Halo-Tag–and the tetrazine and methyl-tetrazine derivatives–for labeling via copper-free click chemistry–showed promising results. This opens the way for a broad application of the chemical switches in the life science, which may now even be used in living genetically modified cells.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Herten, Prof. Dr. Dirk-Peter
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 21 October 2016
Date Deposited: 28 Nov 2016 13:31
Date: 2016
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Fluoreszenzsonde, Fluoreszenzmikroskopie, Hochauflösung
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