German Title: Das Methylom des Marmorkrebses Procambarus virginalis

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Abstract

DNA methylation in invertebrates seems to play a different role as in mammals and its evolutionary conservation among invertebrates is unclear. Only two studies describe crustacean methylomes giving just a small overview. The parthenogenetic reproducing marbled crayfish display a high environmental adaptability besides its genetic uniformity and thus, possess the necessary attributes of a laboratory model organism. The aim of this work was to characterize the methylome of the marbled crayfish at single-base resolution using whole-genome bisulfite sequencing in an attempt to give new insights into DNA methylation in crustaceans and thus, in the evolutionary conservation among invertebrates. Analysis of the mitochondrial DNA of different marbled crayfish strains revealed a single origin and suggests to consider the marbled crayfish as independent asexual species Procambarus virginalis. Furthermore, since the P. virginalis possess a large genome size, the transcriptome was assembled and comparison to other species revealed a relative good quality of the first draft transcriptome as well as the presence of a conserved DNA methylation system in P. virginalis. Analysis of the CpG depletion in protein-coding sequences and mass spectrometry confirmed historical germline and current DNA methylation in various tissues of P. virginalis. The methylome was characterized by the key features of animal methylomes with methylation targeted to gene bodies. The gene bodies displayed the typical pattern of a mosaically methylated invertebrate genome and a bimodal distribution of their methylation levels. Targeted gene bodies were annotated as housekeeping genes and methylation showed a parabolic relationship to housekeeping gene expression suggesting that the DNA methylation of housekeeping genes might fine-tune their expression. Additionally, repeats were generally hypomethylated and the methylation of repeats depended on their position to gene bodies. Finally, inter-individual and inter-tissue comparison of gene body methylation revealed a high reproducibility of the methylation patterns, while inter-species comparison between P. fallax and P. virginalis displayed an overall hypomethylation in the P. virginalis genes which however, could not explain the by mass spectrometry detected global hypomethylation in P. virginalis. These findings uncovered that the P. virginalis methylome is characterized by tissue-invariant housekeeping gene methylation. This thesis describes novel insights into the evolutionary conservation of gene body and repeat methylation in invertebrates, especially crustaceans, and the preferential methylation of housekeeping genes highlights a functional difference to the tissue-specific methylation in mammals.

Translation of abstract (German)

Die Bedeutung der DNA-Methylierung in Invertebraten scheint unterschiedlich zu der in Säugetieren zu sein und ihre evolutionäre Konservierung innerhalb der Invertebraten ist unklar. Bisher geben nur zwei Studien einen groben Überblick über Krebstiermethylome. Der parthenogene Marmorkrebs weist trotz seiner genetischen Uniformität eine hohe Umweltadaptabilität auf und verfügt aus diesem Grund über die notwendigen Eigenschaften eines Modellorganismus. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Methylom des Mamorkrebses auf dem Auflösungsvermögen einzelner Basen mittels Whole-Genome Bisulfite Sequencing zu charakterisieren, um neue Einblicke in die Methylierung in Krebstieren und die evolutionäre Konservierung innerhalb der Invertebraten zu gewinnen. Die Analyse der mitochondrialen DNA von verschiedenen Mamorkrebspopulationen belegt einen gemeinsamen Ursprung und legt die Betrachtung des Mamorkrebses als unabhängige asexuelle Art, Procambarus virginalis, nahe. Aufgrund des großen Genoms von P. virginalis wurde das Transkriptom assembliert. Der Vergleich zu anderen Arten zeigte, dass die erste Version eine gute Qualität hat und ein konserviertes DNA-Methylierungs-System beinhaltet. Die CpG-Depletion in Transkriptsequenzen und die massenspektrometrische Analyse bestätigten eine historische Keimbahn- sowie gegenwärtige DNA-Methylierung in verschiedenen Geweben von P. virginalis. Das Methylom von P. virginalis wies die wichtigsten Merkmale von Tiermethylomen auf, wie z.B. die Genmethylierung. Die Genmethylierung war bimodal verteilt und hatte das typische Muster eines mosaik methyliert Invertebratengenoms. Primär waren die Housekeeping-Gene methyliert mit einer parabolischen Beziehung zu ihrer Expression, was darauf hindeutet, dass die DNA-Methylierung von Housekeeping-Genen ihre Expression feinabstimmt. Die Repeats waren generell hypomethyliert und ihre Methylierung war abhängig von ihrer Position zu den Genen. Der Vergleich der Genmethylierung zwischen Individuen und Geweben wies eine hohe Reproduzierbarkeit der Methylierungsmuster auf, während der Vergleich zwischen P. fallax und P. virginalis eine Genhypomethylierung in P. virginalis aufzeigte. Diese kann jedoch nicht die mittels Massenspektrometrie detektierte globale Hypomethylierung in P. virginalis erklären. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass das P. virginalis Methylom durch gewebsinvariante Housekeeping-Gen-Methylierung gekennzeichnet ist und die bevorzugte Methylierung von Housekeeping-Genen in P. virginalis untermauert einen funktionellen Unterschied zur gewebespezifischen Methylierung in Säugetieren. Mit dieser Arbeit werden neue Einblicke in die evolutionäre Konservierung von Gen- und Repeatmethylierung in Invertebraten, insbesondere Krebstieren ermöglicht.