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Point Mutations in Nonstructural Coding Sequences of Rat H-1 Parvovirus and Consequences for Virus Fitness

Hashemi, Hamidreza

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Abstract

Some rodent parvoviruses including rat H-1PV virus are of particular importance for cancer therapy because of their intrinsic oncotropism owing to strict dependence on DNA replication machinery and other cellular factors that are provided by cells only when going through S phase of the cell cycle, a hallmark of transformed cells. Isolation of mutant viruses that replicate more efficiently in cancer cells has been used as a strategy to improve oncolytic properties of viruses. Previously in our lab, a fully infectious H-1PV mutant containing a 114 nt in-frame deletion in NS coding sequences (DelH-1PV) was analyzed by Weiss et al. This mutant exhibited key fitness features including enhanced infectivity in vitro and stronger anti-tumor activity in vivo compared to wt virus. Significant improvements in both early and late steps of the virus cycle were observed including a more efficient virus binding and uptake by host cells leading to earlier viral DNA replication, and earlier/faster nuclear export of infectious virions. In the current study, the effects of the above-mentioned deletion on virus fitness was further investigated by introducing point mutations in this region. The mutations clustered in the NS1/2-coding DNA sequence corresponding to the deletion sequence in DelH-1PV. Four mutants (H1-PM-I, H1-PM-II, H1-PM-III and H1-DM) were generated in which either NS2 (PM-II and PM-III) or NS1 and NS2(PM-I and DM) were modified and analyzed for their fitness phenotype. Our results show that the mutations PM-I, PM-II and DM improved some early steps of the infection cycle indicated by more efficient cell uptake of the virus particles. Viral DNA replication was stimulated by these mutations leading to higher production of progeny virions and better spread of the virus. To analyze the fitness effects of NS1 mutation (Y595H) independently of NS2, NS2-null derivatives were created. Our data showed that the NS1Y595H mutation stimulates viral DNA replication and spread in the absence of NS2. In contrast, PM-III mutation in NS2 (L153M) compromised virus replication and spread, indicated by a small plaque phenotype, lower yield and infectivity of the progeny particles. However, cellular binding and uptake of the virus particles were not impaired by this mutation. A strong cis effect of PM-III mutation on capsid production was observed at a post-transcriptional level. Altogether our results suggest that PM-III mutation may interfere with efficient translation of downstream open reading frame (capsid ORF) and efficient splicing of VP1/VP2 pre-mRNA leading to decreased and imbalanced production of the capsid proteins and consequently inefficient generation of pre-assembled capsids.

Translation of abstract (German)

Einige Nager-Parvoviren, darunter auch das H-1PV der Ratte, sind von speziellem Interesse für die Krebstherapie dank ihres intrinsischen Oncotropismus, der sie von der DNAReplikationsmaschinerie abhängig macht und von anderen zellulären Faktoren, die von der Zelle nur während der S-Phase des Zellzyklus bereitgestellt werden – ein Kennzeichen transformierter Zellen. Die Isolation mutanter Viren mit gesteigertem Replikationspotential in Krebszellen wurde als Strategie verwendet, um die oncolytischen Eigenschaften des Virus zu verbessern. In einer vorhergehenden Arbeit unseres Labors untersuchten Weiss et al einen voll-infektiösen Mutanten von H-1PV, der eine 114 nt in-frame Deletion in der NS-kodierenden Sequenz (DelH- 1PV) trug. Verglichen mit dem wt Virus zeigte diese Mutante entscheidende Fitness- Eigenschaften, darunter eine erhöhte Infektiosität in vitro und eine verstärkte anti-Tumor Aktivität in vivo. Signifikante Verbesserungen wurden beobachtet sowohl in frühen als auch in späten Schritten des viralen Zyklus, einschließlich einer effizienteren Bindung und Aufnahme durch Wirtszellen, was zu einer früheren DNA Replikation führte, und früherer/schnellerer Export von infektiösen Virionen aus dem Nucleus mit sich trug. In der aktuellen Studie wurden die Effekte der oben-beschriebenen Deletion auf die Fitness des Virus weiter untersucht indem Punktmutationen in diese Region eingeführt wurden. Die Mutationen befanden sich in der NS1/NS2-kodierenden DNA Sequenz, die der Deletions-sequenz im DelH-1PV entspricht. Vier Mutanten (H1-PM-I, H1-PM-II, H1-PM-III und H1-DM) wurden hergestellt, bei denen entweder NS2 (PM-II und PM-III) oder NS1 und NS2 (PM-I und DM) verändert wurden. Anschließend wurde der Fitness-Phänotyp der Mutanten untersucht. Unserer Ergebnisse zeigen, dass die Mutationen PM-I, PM-II und DM einige frühe Schritte des Infektionszyklus verbesserten, was sich durch eine effizientere Aufnahme der Virenpartikel äußerte. Die virale DNA Replikation wurde durch diese Mutationen gefördert, was zu einer erhöhten Produktion von Nachkommenviren und einer verbesserten Verbreitung des Virus führte. Um die Fitnessassoziierten Effekte der NS1 Mutation (Y595H) unabhängig von NS2 zu untersuchen, wurden NS2-null Mutanten hergestellt. Unsere Daten zeigten, dass die NS1Y595H Mutation in Abwesenheit von NS2 die virale DNA Replikation und die Verbreitung des Virus fördert. Die PMIII Mutation in NS2 (L153M) beeinträchtigte dagegen die virale Replikation und Verbreitung, was sich in einem Phänotyp von kleinen Plaques, geringerer Ausbeute und geringerer Infektiosität der Nachkommenviren äußerte. Allerdings wurde die zelluläre Bindung und Aufnahme der Virenpartikel nicht durch diese Mutation behindert. Auf post-transkriptioneller Ebene wurde ein starker cis Effekt der PM-III Mutation beobachtet, der sich auf die Produktion von Kapsiden auswirkte. Zusammengefasst weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass die PM-III Mutation eine effiziente Translation von downstream liegenden offenen Leserastern (Kapsid-OLR) und effizientes Splicing von VP1/VP2 pre-mRNA beeinträchtigt, was zu einer verringerten und unausgeglichenen Produktion von Kapsidproteinen führt und eine uneffiziente Herstellung von prä-assemblierten Kapsiden zur Folge hat.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dinsart, Dr. Christiane
Date of thesis defense: 16 February 2017
Date Deposited: 17 Mar 2017 09:19
Date: 2017
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
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