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Abstract

The Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA) axis and its final effector, glucocorticoids (GCs), are important players in maintaining homeostasis of an organism upon stress exposure. However, overexposure to GCs during early life is involved in developmental programming of the HPA axis and is linked to detrimental effects in health. The hypothalamus is a key target for developmental programming due to its pivotal role as an integrator of input signals coming from sensory systems and other brain regions and as a translator of neuronal signals into endocrine signals. Yet, little is known about the molecular mechanisms involved in hypothalamic programming mediated by stressful experiences during early life. Elucidation of these mechanisms is essential for understanding the link between early life stress, dysregulation of the stress response, and detrimental health in later stages. Here, I used the zebrafish model to elucidate the molecular correlates of early adverse experience in hypothalamic cells. First, I developed a stimulation protocol using vortex flows to activate the hypothalamic-pituitary-interrenal (HPI) axis, the homolog of the HPA axis in teleost, and characterized the stress response at early stages by measuring cortisol (the main GC in zebrafish) and behavioral correlates. I then identified a critical time window in which HPI axis activity matures. Subsequently, I established an early life stress protocol to induce hypercortisolic states and alter stress response maturation. Endocrinological, behavioral, and cellular characterization of the early life stress paradigm showed an overall downregulation of the stress response with attenuated locomotor and cortisol response to subsequent stressful events as well as reduced calcium activity and expression of stress related peptides (AVP, CRH, and OXT) in hypothalamic cells. To dissect the molecular correlates of early adverse experience, I then performed transcriptomic analysis of hypothalamus-specific cell populations after exposure to the early life stress paradigm. Candidate molecules involved in the adaptive process occurring in hypothalamic cells were identified. Moreover, gene ontology and pathway analysis showed that lipid metabolism and molecular transport pathways were downregulated after zebrafish larvae were subjected to the early life stress protocol. In contrast, cellular movement and inflammatory response pathways were upregulated. Finally, I characterized the cortisol profiles of optogenetic and targeted transgenic tools which have been generated to manipulate the HPI axis activity in freely swimming larvae. Here, I show evidence of altered levels of endogenous cortisol in larvae that were manipulated at any of the three levels of the HPI axis. Altogether, the main contributions of this thesis are: 1) establishment of a novel stress protocol to activate the HPI axis in zebrafish larvae in a highly controlled and strength-dependent manner; 2) characterization of the cortisol response of developing zebrafish and identification of a critical time window of stress response maturation; 3) development of an early life stress paradigm and elucidation of the effects of early adverse experience at the cellular, behavioral, and endocrinological level; 4) identification of candidate molecules and metabolic pathways in hypothalamic cells involved in adaptive processes after early adverse experience, and 5) characterization of the cortisol profiles of optogenetic and genetic tools to manipulate the HPI axis activity at any of its three levels (hypothalamus, pituitary, and interrenal gland).

Translation of abstract (German)

Die Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA)-Achse und ihre Endsignalstoffe, die Glucocorticoide (GCs), sind wichtige Spieler bei der Aufrechterhaltung der Homöostase eines Organismus unter Stresseinwirkung. Allerdings ist eine übermäßige Einwirkung von GCs früh im Leben an der Programmierung der HPA-Achse während ihrer Entwicklung beteiligt und wird mit gesundheitsschädlichen Effekten in Verbindung gebracht. Der Hypothalamus ist ein Hauptziel für Programmierung während der Entwicklung aufgrund seiner entscheidenden Rolle als Integrator von einkommenden Signalen der sensorischen Systeme und anderer Hirnregionen, und als Übersetzer neuronaler Signale in endokrine Signale. Dennoch ist wenig über die durch stressige frühe Erfahrungen vermittelten molekularen Mechanismen bekannt, die an hypothalamischer Programmierung beteiligt sind. Eine Aufklärung dieser Mechanismen ist entscheidend für das Verständnis der Verbindungen zwischen Stress früh im Leben, Fehlregulation der Stressantwort, und Gesundheitsschäden in späteren Stadien. In der vorliegenden Arbeit benutzte ich den Zebrafisch als Modell, um die molekularen Korrelate von frühen negativen Erlebnissen in hypothalamischen Zellen aufzuklären. Zuerst habe ich ein Stimulationsprotokoll mit Wirbelströmungen entwickelt, um die Hypothalamic-Pituitary-Interrenal (HPI)-Achse zu aktivieren, die in Teleostei homolog zur HPA-Achse ist, und habe die Stressantwort in frühen Entwicklungsstadien durch Messung von Cortisol (des primären GCs im Zebrafisch), und korrelierendes Verhalten charakterisiert. Weiterhin habe ich ein kritisches Zeitfenster identifiziert, in dem die Aktivität der HPI-Achse ausreift. Anschließend habe ich ein Protokoll für Stress früh im Leben etabliert, um hypercortisolische Zustände zu erzeugen und die Reifung der Stressantwort zu verändern. Endokrinologische, verhaltensbiologische und zelluläre Charakterisierung dieses „early life stress paradigms“ zeigte eine generelle Herabregulierung der Stressantwort mit gedämpften lokomotorischen und Cortisolantworten auf nachfolgende Stressereignisse, und verringerte Calciumaktivität und Expression stressrelevanter Peptide (AVP, CRH und OXT) in hypothalamischen Zellen. Um molekulare Korrelate früher negativer Erlebnisse zu untersuchen, habe ich danach eine Transkriptomanalyse von Hypothalamus-spezifischen Zellpopulationen nach Einwirkung des „early life stress paradigms“ durchgeführt. Kandidatenmoleküle wurden identifiziert, die im Anpassungsprozess involviert sind und in hypothalamischen Zellen vorkommen. Außerdem zeigte eine Gen-Ontologie- und Signalweganalyse, dass Lipidmetabolismus und molekulare Transportwege herunterreguliert wurden, nachdem Zebrafischlarven dem „early life stress“-Protokoll ausgesetzt waren; andererseits wurden Zellmotilitäts- und Entzündungsreaktionswege heraufreguliert. Schließlich habe ich die Cortisolprofile von optogenetischen und genetischen Werkzeugen charakterisiert, die zur Manipulation der HPI-Achsenaktivität in freischwimmenden Larven entwickelt wurden. Hier zeige ich Nachweise veränderter endogener Cortisolspiegel in Larven, die auf jeder der drei Ebenen der HPI-Achse manipuliert wurden. Zusammenfassend sind die hauptsächlichen Beiträge dieser Arbeit: 1) Etablierung eines neuartigen Stressprotokolls zur Aktivierung der HPI-Achse in Zebrafischlarven auf hochgradig kontrollierte und stärkeabhängige Weise; 2) Charakterisierung der Cortisolantwort von sich entwickelnden Zebrafischen und Identifizierung eines kritischen Zeitfensters der Stressantwortreifung; 3) Entwicklung eines „early life stress paradigms“ und Aufklärung der Effekte früher negativer Erlebnisse auf der zellulären, endokrinologischen und Verhaltensebene; 4) Identifizierung von Kandidatenmolekülen und metabolischen Signalwegen in Hypothalamuszellen, die in Anpassungsprozesse nach früher negativer Erfahrung involviert sind, und 5) Charakterisierung von Cortisolprofilen optogenetischer und genetischer Werkzeuge zur Manipulation der HPI-Achsenaktivität auf jeder ihrer drei Ebenen (Hypothalamus, Hypophyse und Interrenalorgan).