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Molecular Mechanism of Chromosome Segregation by the E. coli Min system

Klauss, Linda Elisabeth

German Title: Molekulare Mechanismen der Chromosomensegregation durch das E. coli Min-System

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Abstract

Cell division is one of the most essential processes underlying life. Of importance is certainly the equal partitioning of the genetic material into the two daughter cells termed chromosome segregation. It is still debated if entropic forces alone are sufficient to fulfill this task, or whether additional dedicated protein machineries play an active role in this process.

The E. coli Min system, consisting of the proteins MinC, MinD and MinE, is well known for its function in defining mid-cell and directing there the FtsZ-ring, which marks the position of the future division site. The Min system is characterized by a pole-to-pole oscillation, corresponding to a time-averaged bipolar protein distribution. It has been discovered in our lab that MinD is able to directly bind DNA in vitro and in vivo. This led to the proposal of a Brownian Ratchet-like model for chromosome segregation, in which membrane-bound MinD provides DNA tethering sites and biases the diffusion of the duplicated chromosomes in the direction of the poles. However, the molecular details of this mechanism were still lacking.

Here I used several in vitro and in vivo assays to understand better how MinD binds to the DNA and to clarify what the role of other proteins, such as MinC, MinE and FtsZ, is. Specifically, I performed ChIP-Seq to study the genome-wide binding of MinD in cells with and without the endogenous Min system and found that MinD does not associate to specific chromosomal macrodomains. This supports the notion that the Min system assists the segregation of the chromosomal bulk. Furthermore, analysis of the transcriptome revealed that the Min system does not function as a global transcriptional regulator.

Using electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) with purified proteins, I established that the MinC-MinD complex has a much higher affinity for DNA than the individual proteins. Lipid vesicles coated with MinC-MinD complexes could tether plasmid DNA to the lipid-associated pellet in co-sedimentation assays. These findings advocate for a refined model in which the “working unit” in chromosome segregation in vivo is not MinD alone, but rather the MinC-MinD complex. MinE is able to dissociate the DNA from the MinC-MinD complex, suggesting a role for this protein in the termination of the transient membrane tethering of the DNA by the Min system in vivo.

Using rational mutagenesis of MinC and MinD, I could pinpoint several residues that are important for the binding and discovered the critical role of the N-terminal domain of MinC.

To clarify whether the recently reported MinC-MinD co-polymers are needed for DNA-binding, I performed in vitro assays mixing wild type MinC with the MinCR133A mutant that allows complex formation between a MinD dimer and a MinC-MinCR133A heterodimer, but not the formation of the co-polymers. Interestingly, in this case, DNA-binding was reduced by 75%.

Finally, since in vivo the Min system interacts with FtsZ for its function in mid-cell placement, I studied whether FtsZ could interfere with DNA-binding by MinC-MinD using in vitro assays. I found that the binding is not affected unless FtsZ is present at very high concentrations. These data suggest that the presence of FtsZ in the cell, away from the Z-ring, does not interfere with DNA-binding by the MinC-MinD complex.

Taken together, the data I collected during my doctoral work contributed to our understanding of the molecular mechanism of DNA-binding by the Min system. More comprehensive studies in live cells are required to study this mechanism in vivo in more detail. Future work is needed to unambiguously determine the surface of the MinC-MinD complex used for direct DNA-binding.

Translation of abstract (German)

Zellteilung ist einer der wichtigsten Prozesse des Lebens. Während der Zellteilung ist es essentiell, dass das genetische Material gleichmäßig auf die beiden Tochterzellen aufgeteilt wird. Dieser Vorgang heißt Chromosomensegregation. Unklar ist, ob entropische Kräfte alleine ausreichend sind, diese Aufgabe zu erfüllen, oder ob es bestimmte, proteingesteuerte Mechanismen gibt, die eine aktive Rolle in der Chromosomensegregation spielen.

Das E. coli Min System besteht aus den Proteinen MinC, MinD und MinE und bestimmt während der Zellteilung die Zellmitte, wohin es die Teilungsmachinerie dirigiert. Dieser Effekt wird erreicht durch das abgestimmte Oszillieren der drei Min Proteine zwischen den beiden Zellpolen. Dabei ist die Aufenthaltswahrscheinlichkeit in der Zellmitte am geringsten, wodurch FtsZ an die Membran binden kann und die Bildung des Septums initiiert. Zusätzlich kann MinD direkt an die DNA binden, was in unserem Labor in vivo und in vitro gezeigt wurde. Daher schlagen wir das Brownsche Ratsche Model für die Chromosomensegregation vor. In diesem Model dient membrangebundenes MinD als DNA Bindestelle und beeinflusst die Diffusion der duplizierten Chromosomen in Richtung der Zellpole. Allerdings sind die Details dieses Mechanismus auf der molekularen Ebene noch ungeklärt.

In der vorliegenden Arbeit wurde mittels in vitro und in vivo Analysen untersucht, wie MinD an die DNA bindet und was die Aufgaben der anderen Proteine wie MinC, MinE und FtsZ sind. Im Einzelnen wurde ChIP-Seq in Zellen mit und ohne endogenem Min System angewandt, um genomweit Bindestellen von MinD zu identifizieren. Dabei wurde festgestellt, dass MinD nicht an eine bestimmte Macrodomäne im Genom bindet. Diese Feststellung stützt die Theorie, dass das Min System unspezifisch zur Teilung des gesamten Genoms beiträgt. Außerdem konnte durch die Analyse des Transkriptoms gezeigt werden, dass das Min System nicht als globaler Regulator der Transkription agiert.

Durch elektrophoretische Mobilitäts-Shiftassays (EMSAs) mit aufgereinigten Proteinen konnte nachgewiesen werden, dass der MinC-MinD Komplex eine weitaus größere Affinität zu DNA hat als die einzelnen Proteine an sich. Auch konnten Lipidvesikel, die mit MinC MinD Komplexen beschichtet sind, Plasmid-DNA zusammen mit dem Lipid assoziierten Pellet sedimentieren. Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, dass die „Arbeitseinheit“ in der Chromosomensegregation in vivo aus dem MinC-MinD Komplex besteht und nicht wie bisher angenommen aus MinD alleine. MinE wiederum kann die DNA vom MinC MinD Komplex entfernen, wodurch MinE vermutlich die Auflösung der transienten Bindung der DNA an die Zellmembran durch das Min System in vivo übernimmt.

Durch rationale Mutagenese von MinC und MinD konnte ich einige Aminosäuren bestimmen, die eine wichtige Rolle in der DNA Bindung spielen. Außerdem konnte die entscheidende Rolle der N terminalen Domäne von MinC aufgedeckt werden.

Um aufzuklären, ob die kürzlich beschriebenen MinC-MinD Kopolymere gebraucht werden um die DNA zu binden, haben wir in vitro wild-typ MinC mit der MinCR133A Mutante gemischt, sodass Komplexbildung zwischen einem MinD Dimer und einem MinC-MinCR133A Heterodimer möglich war, nicht jedoch die Ausbildung von Kopolymeren. Interessanterweise wurde dadurch die DNA Bindung um 75% reduziert.

Abschließend untersuchten wir, ob FtsZ die DNA Bindung durch MinC-MinD in vitro beeinträchtigen kann, da es in vivo mit dem Min System interagiert um die Zellmitte festzulegen. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass die DNA Bindung nicht beeinträchtigt wird, außer FtsZ liegt in hohen Konzentrationen vor. Diese Daten weisen darauf hin, dass zelluläres FtsZ die DNA Bindung des MinC-MinD Komplex nicht behindert.

Zusammenfassend tragen die während meiner Doktorarbeit gesammelten Erkenntnisse zum Verständnis der molekularen Mechanismen der DNA Bindung durch das Min System bei. Weitere Experimente waeren sinnvoll, um die DNA-bindende Oberfläche des MinC-MinD Komplexes eindeutig zu bestimmen. Detailliertere Studien an lebenden Zellen waeren erforderlich, um den Einfluss des Min-Systems auf die Chromosomensegregation in vivo zu erforschen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Eils, Prof. Dr. Roland
Place of Publication: Heidelberg, Germany
Date of thesis defense: 23 June 2017
Date Deposited: 02 Aug 2017 08:31
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Mikrobiologie, Biochemie, Escherichia coli, Segregation <Genetik>
Uncontrolled Keywords: Min System
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