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The impact of Cyclosporine A on human epidermal keratinocytes

Schardt, Lisa

German Title: Der Einfluss von Cyclosporine A auf humane epidermale Keratinozyten

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Abstract

Increased incidence of cutaneous squamous cell carcinomas (cSCCs) in organ transplant recipients is frequently associated with the immunosuppressive drug Cyclosporine A (CsA). Besides its therapeutic effect on the immune surveillance, evidence is accumulating for an immunity-independent mechanism of CsA on non-immune cells. However, the effects described so far are highly diverse and its long-term influence on human keratinocytes within a tissue context is largely unknown. Using a 3D organotypic skin culture model (OTC), for long-term treatment of keratinocytes within a physiologically relevant environment, we showed that CsA improved the stratification and differentiation of moderately differentiating HaCaT cells and of poorly differentiating HaCaT-RAS A-5 cells. This was demonstrated by histology and immunofluorescent stainings for differentiation markers, as well as differential RNA expression of several genes associated with the GO-term ‘epidermal development’. Improved differentiation was also demonstrated by an enhanced transepithelial electrical resistance, a trait directly correlated with the epidermal barrier function. However, CsA did not induce enhanced proliferation or invasion of neither HaCaT nor HaCaT-RAS A-5 cells grown in OTCs. In order to determine, whether UV irradiation as a co-carcinogen would enable invasive growth of CsA-treated HaCaT or HaCaT-RAS A-5 cells, OTCs were continuously irradiated with UV in combination with continuous CsA treatment. However, this did not induce tumorigenic transformation. Instead we found that UV irradiation and the combination of UV+CsA induced a similar regulation pattern of ‘epidermal development’ genes as did CsA alone, suggesting a common regulatory mechanism induced by CsA treatment and UV irradiation. In general, HaCaT epithelia only survive for a restricted time span in OTCs. After 4 to 5 weeks the epithelia become atrophic. Importantly, CsA reproducibly extended the life span of the HaCaT epithelia, by retaining more vital basal and suprabasal keratinocytes. As indicated from an expression array and Ingenuity® Pathway Analysis, CsA reduced cell death in these OTCs, possibly through HGF or Integrin signaling. Having to use different serum batches for our experiments, we finally discovered that by the addition of a specific fetal calf serum HaCaT cells, in addition to the above described characteristics, became invasive when treated with CsA. Invasion was demonstrated by disruption of the basement membrane and penetration of HaCaT cells into the underlying dermal equivalent. This was associated with a tremendous increase in differentially expressed genes as compared to the serum conditions that did not allow for CsA-induced HaCaT invasion. Together, our data confirm that in general CsA is not directly transforming keratinocytes into cancer cells under every condition. Instead our data suggest that CsA improves keratinocyte differentiation, in particular in cells with aberrant epidermal differentiation and promotes their longevity. By chance, however, we experienced that, depending on certain serum factors, CsA could also rapidly induce invasion/tumorigenicity – thus simulating a situation typical for a subgroup of transplant recipients, who rapidly develop multiple cSCCs, also termed cutaneous carcinomatous catastrophe. With these findings our study is now suited for an in depth analysis to unravel the pathways sensitizing HaCaT cells for invasive growth. This knowledge may finally help to identify targets to counteract this devastating CsA-dependent side effect.

Translation of abstract (German)

Das erhöhte Auftreten des kutanen Plattenepithelkarzinoms in Patienten mit Organtransplantat wird häufig mit dem Immunsuppressivum Cyclosporin A (CsA) assoziiert. Zusätzlich zu seinem therapeutischen Einfluss auf die Immunüberwachung, werden immer mehr Hinweise auf einen immun-unabhängigen Mechanismus von CsA auf nicht-Immunzellen publiziert. Jedoch sind diese beschriebenen Effekte zum Teil höchst unterschiedlich und die Langzeiteffekte von CsA auf humane Keratinozyten innerhalb eines Gewebekontext sind weitestgehend unbekannt. Mit Hilfe von 3D organotypischen Hautkulturen (OTKs), die eine Langzeitbehandlung mit CsA in einer physiologisch relevanten Umgebung erlauben, konnten wir zeigen, dass CsA die Stratifizierung und die Differenzierung von moderat differenzierenden HaCaT Zellen, so wie die von schlecht differenzierenden HaCaT-RAS A-5 Zellen, verbessert hat. Dies wurde durch die Histologie, durch Immunfluoreszenz-Färbungen von Differenzierungsmarkern, so wie an Hand von differentiell regulierter Gene, die Teil des GO-terms ‚epidermal development‘ sind, gezeigt. Verbesserte Differenzierung konnte auch durch einen erhöhten transepithelialen elektrischen Widerstand nachgewiesen werden. Dieser steht im direkten Zusammenhang mit der epidermalen Barrierefunktion. Wir konnten jedoch weder erhöhte Proliferation noch invasives Wachstum nach CsA-Behandlung feststellen. Um zu überprüfen ob UV-Bestrahlung als Co-Karzinogen invasives Wachstum von CsA-behandelten HaCaT oder HaCaT-RAS A-5 Zellen zulässt, wurden OTKs parallel zu der kontinuierlichen CsA-Behandlung kontinuierlich mit UV bestrahlt. Auch diese Kombination aus UV+CsA konnte die Zellen nicht tumorigen transformieren. Stattdessen haben wir festgestellt, dass die UV-Bestrahlung und die Kombination UV+CsA ein ähnliches Regulationsmuster der ‚epidermal development‘ Gene hervorruft, wie das der alleinigen CsA-Behandlung. Daher lässt es sich mutmaßen, dass die CsA-Behandlung und die UV-Bestrahlung einen gemeinsamen regulatorischen Mechanismus induziert haben. Generell überleben HaCaT Zellen in OTKs nur für einen begrenzten Zeitraum. Nach 4 bis 5 Wochen werden die Epithelien atrophisch. CsA hat jedoch in reproduzierbaren Experimenten die Lebensdauer dieser HaCaT Epithelien verlängert, in dem es mehr vitale basale und suprabasale Keratinozyten erhalten hat. Wie durch eine Genexpressionsanalyse und anschließender Ingenuity® Pathway Analysis indiziert wurde, hat CsA den Zelltod reduziert, möglicherweise durch den HGF oder Integrin Signalweg. Da es notwendig war verschiedene Seren für unsere Experimente zu benutzen, haben wir festgestellt, dass in einem bestimmten Serum HaCaT Zellen, zusätzlichen zu den oben beschriebenen Charakteristika, invasiv gewachsen sind wenn diese mit CsA behandelt wurden. Dies wurde durch die Unterbrechung der Basalmembran und die Infiltration von HaCaT Zellen in die darunter liegende Dermis gezeigt. Darüber hinaus wurden mehr Gene differentiell reguliert, im Vergleich zum anderen Serum, das keine CsA-induzierte Invasion zugelassen hat. Zusammengefasst zeigen unsere Daten, dass CsA grundsätzlich nicht unter allen Bedingungen Keratinozyten zu Krebszellen transformiert. Stattdessen haben unsere Daten demonstriert, dass CsA die Differenzierung von Keratinozyten verbessert, vor allem in Zellen mit aberranter epidermaler Differenzierung, sowie deren Langlebigkeit fördert. Durch Zufall haben wir jedoch festgestellt, dass abhängig von bestimmten Serumfaktoren, CsA auch Invasion/Tumorigenität induzieren kann. Dies spiegelt auch die Situation einiger Patienten mit Organtransplantat wider, die innerhalb kürzester Zeit etliche Plattenepithelkarzinome, auch ‚cutaneous carcinomatous catastrophe‘ genannt, bekommen. Mit Hilfe unserer Daten ist unsere Studie nun für tiefergehende Analysen bereit, um Signalwege zu identifizieren die HaCaT Zellen für die Invasion sensibilisieren. Mit diesem Wissen könnten schlussendlich biologische Targets entdeckt werden, die diesem verheerenden Nebeneffekt von CsA entgegenwirken könnten.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Angel, Prof. Dr. Peter
Date of thesis defense: 3 May 2017
Date Deposited: 02 Aug 2017 09:25
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
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