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Klonierung und Co-Expression der Tryptophan-Decarboxylase, Strictosidinsynthase und Strictosidinglucosidase, dreier Schlüsselgene der Monoterpenindolalkaloid-Biosynthese aus Catharanthus roseus (L.) G. DON

Dziggel, Clarissa

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PDF, German
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Abstract

Strictosidin ist der gemeinsame Vorläufer vieler medizinisch relevanter, pflanzlicher Monoterpenindolalkaloide, deren Produktion in der Pflanze häufig nicht ausreicht, um den steigenden Marktbedarf zu decken. Die Produktion dieser Alkaloide bzw. ihres Vorläufers Strictosidin in einem mikrobiellen heterologen System könnte eine Alterna-tive zur Synthese/Produktion in der Pflanze bieten. In dieser Arbeit wurde daher ein System zur Co-Expression von drei Schlüsselgenen der Catharanthus roseus Monoterpenindolalkaloid-Biosynthese entwickelt, das die gleichzeitige funktionelle Expression der Tryptophandecarboxylase (TDC), der Stricto-sidinsynthase (STR) und der Strictosidinglucosidase (SGD) in Escherichia coli ermög-licht. Um dies zu erreichen, wurden zunächst zwei unterschiedliche Expressionssysteme auf ihre Eignung hin untersucht. Zum einen wurde mit Pichia pastoris, ein eukaryotes Sys-tem getestet, zum anderen mit Escherichia coli, ein prokaryotes. Für beide Systeme wurden verschiedene Vektorkonstrukte zur Einzelexpression der Catharanthus-Gene hergestellt und deren Funktionalität im jeweiligen System/Organismus überprüft. Die Gene der STR und SGD wurden für die Expression in E. coli Codon-optimiert. Bei der STR, für die bekannt ist, dass sie in E. coli vermehrt in Form von unlöslichen Inclusion Bodies produziert wird, wurde zusätzlich der Einfluss des Vektors (Kopienzahl) und verschiedener Tag-Sequenzen auf die Expression löslicher, enzymatisch aktiver En-zyme untersucht. Die Aktivität der unterschiedlichen Konstrukte wurde über in vivo Enzymassays in E. coli und anschließendem Nachweis des enzymatischen Produkts Strictosidin mittels HPLC verglichen. Da sich die TDC im P. pastoris System trotz vielfältiger Optimierungsversuche nicht ex-primieren ließ, und die STR trotz nachgewiesener funktioneller Expression nicht aus dem Expressionsmedium gereinigt werden konnte, wurden die Arbeiten mit diesem System eingestellt. Alle Arbeiten zur Produktion der drei Catharanthus-Enzyme erfolg-ten von nun an im E. coli System, in dem sich alle drei Enzyme in löslicher, aktiver Form exprimieren und reinigen ließen. Die gereinigten Enzyme wurden hinsichtlich pH- und Temperaturoptima, kinetischer Parameter Km und Vmax und des Einflusses verschie-dener Aktivatoren und Hemmstoffe charakterisiert. Für die Co-Expression aller drei Gene wurden Doppeltransformanten hergestellt, die zum einen den Vektor pET45b(+)_TDC_C-His und zum anderen den Vektor pCDFDuet1_SGD_STR enthielten. Der Erfolg der Expression wurde über SDS-PAGE, die Funktionalität der gebildeten Enzyme über in vivo Enzymassays mit Tryptophan und Secologanin als Substrate und anschließendem Nachweis der Edukte bzw. Produkte über HPLC bzw. LC-MS überprüft. Als kostengünstigere Alternative wurden auch En-zymassays durchgeführt, bei denen anstelle des reinen Secologanin ein Methanol-Ex-trakt von Symphoricarpos albus Beeren verwendet wurde. Zusätzlich zu den in vivo Klonierungs- und Expressionsarbeiten wurde ein säulenba-siertes System zur in vitro Produktion von Strictosidin mittels rekombinanter STR etabliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern einen ersten Beitrag zur heterologen Produktion pharmazeutisch wichtiger Monoterpenindolalkaloide in einem E. coli System.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wink, Prof. Dr. Michael
Date of thesis defense: 20 June 2017
Date Deposited: 17 Aug 2017 10:04
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
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