German Title: Vakuolenbiogenese in Arabidopsis thaliana

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Abstract

All higher plants form leaves and roots, organs specialized to efficiently absorb carbon dioxide, collect energy from the sunlight and take up water as well as minerals. These tissues usually have a large surface area made up of big cells. To fill the space most resourcefully plant cells developed unique compartments, central vacuoles, which can occupy almost the entire cell volume. The transport of water into vacuoles is much more economical than to generate a similar amount of cytosol, decreasing the metabolic cost of plant growth substantially. Besides, vacuoles fulfill vital functions in storage of nutrients, detoxification of the cytosol, and protein degradation. The physiological roles of vacuoles are well studied but detailed knowledge about how they develop is limited. Due to their gigantic size vacuole biogenesis in plants is not only a matter of balancing incoming vesicle trafficking and membrane turnover, but also requires enormous amounts of membrane in order to enable proper vacuole expansion. The consensus model states that central vacuoles arise by fusion of multiple small organelles, initially formed by a combination of late endosomes and autophagy. However, the mechanistic details are mostly reasoned from 2D electron microscopy images and lack any quantification. In this thesis we analyzed the biogenesis of lytic vacuoles in root tips of Arabidopsis thaliana in more detail. By computing 3D surface renderings of vacuoles we reconstituted their complex tubular network in meristematic cells and discovered that in contrast to the existing model vacuoles develop as a single compartment. This was further substantiated by FRAP-based measurements of vacuolar volumes. Instead of growing by fusion of smaller volumes vacuoles inflate over time until they reach their final size in differentiated cells. Still, we found that vacuole development depends on CORVET/HOPS mediated membrane fusion as indicated by vacuole fragmentation upon induced knockdown of the subunit VPS16. Also, calculating the number and lifetime of late endosomes in elongating cells revealed that their membrane contribution does not allow for the growth rate of vacuoles, suggesting an additional membrane donor. We identified a so far undiscovered pathway that delivers V-ATPases and V-PPases to the tonoplast via an intermediate compartment we termed provacuole. By using different genetic and chemical means to block known vacuolar transport routes we found that provacuole trafficking bypasses Golgi and post-Golgi compartments and does neither require COPII-mediated ER export nor the core autophagy machinery. Most importantly, with a custom-built inducible expression system and 3D super-resolution confocal laser scanning microscopy we were able to calculate that in elongating cells provacuoles provide the majority of the required tonoplast material. In conclusion, the evidence provided in this thesis redefines the model of vacuole biogenesis in Arabidopsis thaliana.

Translation of abstract (German)

Alle höheren Pflanzen bilden Blätter und Wurzeln, Organe die darauf spezialisiert sind Kohlenstoffdioxid zu binden, Energie aus dem Sonnenlicht zu absorbieren und Wasser sowie Mineralien aufzunehmen. Diese Gewebe haben in der Regel eine große Oberfläche, die aus großen Zellen aufgebaut ist. Um diesen Raum möglichst ressourcenschonend auszufüllen, haben Pflanzenzellen einzigartige Kompartimente entwickelt, zentrale Vakuolen, die fast das gesamte Zellvolumen einnehmen können. Der Transport von Wasser in die Vakuolen ist viel ökonomischer als eine vergleichbare Menge an Zytosol zu erzeugen. Dadurch werden die Stoffwechselkosten des Pflanzenwachstums erheblich gesenkt. Neben der Funktion als Wasserreservoir, spielen Vakuolen auch eine zentrale Rolle bei der Speicherung von Nährstoffen und Sekundärmetaboliten, der Entgiftung des Zytosols und dem Abbau von sowohl endozytiertem als auch autophagischen Material. Der Großteil der Forschung konzentrierte sich bisher vor allem auf die physiologischen Funktionen von Vakuolen, aber detaillierte Kenntnisse darüber, wie sie sich entwickeln, sind begrenzt. Aufgrund der enormen Kompartimentgröße ist Vakuolenbiogenese in Pflanzen nicht nur eine Frage der Balance zwischen ankommenden Vesikeln und Membranumsatz, sondern erfordert außerdem enorme Membranmengen, um überhaupt eine ausreichende Vakuolenexpansion zu ermöglichen, vor allem während des Zellwachstums. Das aktuelle Modell besagt, dass zentrale Vakuolen durch das Verschmelzen von mehreren kleinen Vakuolen entstehen, die anfänglich aus einer Kombination von späten Endosomen und Autophagie gebildet wurden. Allerdings wurden diese mechanistischen Details vor allem aus zweidimensionalen elektronenmikroskopischen Aufnahmen abgeleitet und beinhalten keine Quantifizierung. In dieser Arbeit haben wir die Biogenese von lytischen Vakuolen in Wurzelspitzen von Arabidopsis thaliana im Detail analysiert. Durch die Berechnung von dreidimensionalen Oberflächenmodellen von Vakuolen rekonstruierten wir ihre komplexen röhrenförmigen Netzwerke in meristematischen Zellen und entdeckten, dass sich Vakuolen entgegen dem existierenden Modell als ein einziges zusammenhängendes Kompartiment entwickeln. Dies wurde durch "Fluorescence Recovery After Photobleaching" (FRAP) -basierte Messungen von Vakuolenvolumen weiter untermauert. Anstatt durch Verschmelzung von kleineren Volumina zu wachsen, blasen sich Vakuolen im Laufe der Zeit vielmehr auf, bis sie ihre endgültige Größe und Form in differenzierten Zellen erreichen. Dennoch fanden wir heraus, dass diese Vakuolenentwicklung entscheidend von der durch CORVET / HOPS -vermittelten Membranfusion abhängt, was durch stark fragmentierte Vakuolen bei induziertem Knockdown der strukturellen Untereinheit VPS16 gezeigt wurde. Außerdem ergab die Berechnung der Anzahl und Lebensdauer von späten Endosomen in sich streckenden Zellen, dass ihr Membranbeitrag nicht die beobachtete Wachstumsrate von Vakuolen zulässt, was auf einen zusätzlichen Membranzulieferer hindeutete. Diesen haben wir über einen bislang unentdeckten Transportweg identifiziert, der V-ATPasen und V-PPasen über ein intermediäres Kompartiment, welches wir als Provokuole bezeichnet haben, an den Tonoplasten liefert. Durch die Verwendung unterschiedlicher genetischer und chemischer Verfahren, um bekannte vakuoläre Transportwege zu blockieren, haben wir festgestellt, dass der Provokuolentransport Golgi- und Post-Golgi Kompartimente umgeht und weder COPII-vermittelten Export aus dem ER noch die Autophagie-Maschinerie erfordert. Vor allem haben wir mit einem maßgeschneiderten, induzierbaren Expressionssystem und mithilfe von dreidimensionaler konfokaler Hochauflösungs-Laser-Scanning-Mikroskopie berechnen konnten, dass Provokuolen bei der Zellstreckung den Großteil des benötigten Tonoplastenmaterials liefern. Mit den in dieser Arbeit präsentierten Ergebnissen wird das Modell der Vakuolenbiogenese in Arabidopsis thaliana neu definiert.