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Timed genome editing and sporozoite formation in Plasmodium berghei

Singer, Mirko

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Abstract

Plasmodium species are unicellular eukaryotic parasites that are the causative agents of malaria. This disease places a high burden on most tropical countries due to the severity of its symptoms and high prevalence. The absence of sterile immunity under natural transmission conditions, rapidly evolving drug resistance and the lack of a protective vaccine intensify the problem. Plasmodium is a highly adapted intracellular parasite. Plasmodium sporozoites develop within oocysts in the mosquito midgut, enter the salivary glands and are injected into the skin of their mammalian host. Sporozoites reach the liver, develop intracellular within hepatocytes into merozoites and enter red blood cells. Multiplication of parasites in the blood causes the disease. If a mosquito takes a blood meal at this time, the parasites enter the midgut, causing an infection. It has been shown in the past that parasites lacking genes required for liver stage development can be used as an experimental live-attenuated vaccine. Their arrest in the liver allows the host to launch a protective immune response, resulting in sterile protection from sporozoite challenge. Here I investigated if it is possible to exploit parts of the particular biology of Plasmodium, its haploid genome and the limitation of DNA repair to homologous recombination to generate a new generation of experimental vaccines. I generated parasites that express zinc finger nucleases causing a single well-timed double strand break within their own genome using stage specific promoters. This resulted in delayed death of the parasites as they failed to repair their split chromosome. I show that parasites arresting within the liver stage using this method can cause sterile protection from lethal sporozoite challenge. Additionally, rare breakthrough events resulting in blood stage infection were investigated. In these parasites I observed the genetic signature of DNA repair events by microhomology-mediated end joining with as little as four base pairs of homology. The circumsporozoite protein (CSP) is the major surface protein of sporozoites, essential for their formation in the oocyst and despited extensive research its function at this stage is not understood. I used interdomain tagging with green fuorescent protein to study the function of the circumsporozoite protein (CSP). Using live cell microscopy of complete mosquito midguts, electron microscopy of midgut sections and analysis of protein extracts via western blotting I investigated the role of CSP during sporozoite formation. I could show that CSP undergoes previously unrecognized proteolytic processing at the C-terminus within the oocyst. Additionally my results suggest that extensive invagination of the plasma membrane has to occur prior to sporozoite formation and that CSP plays a role in orchestration of these events. This work also highlighted the importance of a previously unappreciated membranous network, the labyrinthine structure, for sporozoite formation. In conclusion this part of my work focuses on sporozoite biology, on their formation in the oocyst and on how to block their development in the liver.

Translation of abstract (German)

Die Erreger der Malaria sind einzellige eukaryotische Parasiten vom Genus Plasmodium. Diese Krankheit betrift die meisten tropischen Länder und verursacht eine hohe gesundheitliche und okonomische Belastung. Das schnelle Auftreten von Resistenzen gegen Medikamente, die Fähigkeit des Parasiten Menschen wiederholt zu infizieren und das Fehlen eines verlässlichen Impfstoffes verstärken das Problem. Sporozoiten entwickeln sich innerhalb von Oozysten im Mitteldarm einer infizierten Stechmücke. Von dort gelangen sie in die Speicheldrüsen und werden bei einem Stich in die Haut gespuckt. Mit dem Blut begeben sie sich zur Leber und entwickeln sich innerhalb von Leberzellen zu Merozoiten. Diese gelangen in das Blut und vermehren sich innerhalb von Erythrozyten, dies führt zu den Symptomen der Malaria. Bei einer Blutmahlzeit werden die Parasiten mit aufgenommen und gelangen wieder in den Mitteldarm des Stechmücke. Es konnte gezeigt werden, dass Parasiten denen essenzielle Gene für die Entwicklung des Leberstadiums fehlen als experimenteller Lebendimpfstoff genutzt werden können. Ihr Absterben in der Leber ermöglicht dem Wirt eine schützende Immunantwort aufzubauen die ihn komplett vor einer Infektion durch Sporozoiten schützt. In dieser Arbeit habe ich untersucht ob es möglich ist die biologischen Besonderheiten von Plasmodium auszunutzen um abgeschwächte Parasiten als experimentelle Impfstoffe herzustellen. Besonders sein haploides Genom und die Beschränkung der DNA-Reparatur auf homologe Rekombination machen ihn angreifbar. Ich habe Parasitenstämme hergestellt, die mit Hilfe von Stadium-spezifischen Promotoren zu einem gewünschten Zeitpunkt Zink Finger Nukleasen exprimieren. Ein einzelner so verursachter Doppelstrangbruch der Parasiten-DNA führt zu ihrem zeitverzögerten Absterben, da sie ihr zerschnittenes Chromosom nicht wieder reparieren können. Ich konnte zeigen, dass eine Immunisierung mit diesen Parasiten zu einem Impfschutz gegen Sporozoiten führt. Zusätzlich wurden selten vorkommende sogenannte Durchbruchinfektionen untersucht. In diesen Infektionen konnte ich anhand der genetische Signatur der Reparaturstelle die Existenz eines alternativen DNA-Reparaturweges nachweisen. Mikrohomologien von nur vier Basenpaaren weisen darauf hin, dass Plasmodium zu der DNA-Reparaturmethode "microhomogy-mediated end joining" fähig ist. Das "circumsporozoite protein" (CSP) ist das häufigste Oberfächenprotein der Sporozoiten. Es ist essentiell für die Bildung der Sporozoiten, doch seine Funktion in diesem Prozess ist trotz großer Anstrengungen noch nicht verstanden. Um seine Funktion zu untersuchen habe ich Parasiten generiert bei denen zwischen den verschiedenen Proteindomänen von CSP das grüne fluoreszierende Protein eingefügt ist. Die Parasiten habe ich mit Lebendfluoreszenzmikroskopie infizierter Mitteldärme, Elektronenmikroskopie und mittels Western-Blotting untersucht. Ich konnte zeigen das CSP an seinem C-Terminus proteolytisch gespalten wird. Die Ergebnisse weisen außerdem darauf hin, dass einer erfolgreichen Sporozoitenbildung die vollständige Invagination der Plasmamembran vorrausgehen muss. CSP ist wichtig für die geordnete Abfolge dieser beiden Prozesse. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass eine bisher vernachlässigtes Membrannetzwerk, die "labyrinthine structure", wichtig für die Bildung der Sporozoiten ist. Zusammenfassend beschäftigt sich diese Arbeit mit der Biologie der Sporozoiten, mit ihrer Entstehung in der Oozyste und damit, wie man ihre Weiterentwicklung in der Leber stoppen kann.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Lanzer, Prof. Dr. Michael
Date of thesis defense: 19 September 2017
Date Deposited: 13 Nov 2017 08:57
Date: 2017
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Medizinische Fakultät Heidelberg > Department for Infectiology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Parasitologie, Malaria, DNS-Reparatur, Impfung, Glykosylphosphatidylinosit-Anker
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