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Identification of regulators of mutant p53 accumulation in lymphoma using RNA interference

Jethwa, Alexander

German Title: Identifizierung von Regulatoren der Akkumulation von mutiertem p53 in Lymphomen mittels RNA-Interferenz

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Abstract

In over 40% of all cancers, the key tumor suppressor p53 is inactivated via mutation. Mutant (mut) p53 can gain new properties (gain-of-function, GOF), which actively contribute to tumorigenesis. In many tumors, a massive accumulation of mutp53 protein is observed and a prerequisite for the GOF activity. Therefore, tumors often depend on sustained high levels of mutp53, which suggests that interfering with mutp53 accumulation may be exploitable in cancer therapy. However, the mechanisms that control excessive mutp53 stabilization are not fully understood. To this end, the main aim of this study was to identify regulators of mutp53 accumulation in Burkitt’s lymphoma (BL) as a model for a highly aggressive cancer.

Despite the presence of functional MDM2, the main negative regulator of p53, mutp53 was found to be stabilized in BL. To identify proteins regulating mutp53 levels in an unbiased fashion, a flow cytometry-based RNA interference (RNAi) screen was conducted in a mutp53 BL cell line model. The primary screen hit was TRRAP (transformation/transcription domain-associated protein), a constituent of several histone acetyltransferase (HAT) complexes. TRRAP knock-down and knock-out resulted in depletion of mutp53 protein (but not mRNA) in lymphoma and colorectal cancer cell lines with a diverse spectrum of p53 mutations. Conversely, TRRAP overexpression increased mutp53 levels. Mass spectrometric analysis of the mutp53 interactome after TRRAP knock-down indicated that TRRAP silencing caused nuclear export of mutp53 and degradation via the MDM2-proteasome axis, suggesting targeting of mutp53 to the physiological p53 degradation machinery. Gene expression profiling after TRRAP knock-down showed a suppression of cell cycle-related genes and an induction of interferon signaling, which however did not contribute to mutp53 regulation. To map functional regions of TRRAP, a CRISPR/Cas9 mutagenesis approach (“CRISPR scanning”) was applied which identified a 109 amino acid region in the N-terminal HEAT repeat region crucial for mutp53 accumulation and cell survival. In wild-type p53 BL cells, TRRAP silencing attenuated p53 stabilization and activity upon genotoxic stress. Finally, to transfer the results from RNAi screening, a drug-based screening was performed and identified that inhibition of histone deacetylases (HDAC) and specifically HDAC1/2/3 decreased mutp53 levels to a surprisingly similar extent as TRRAP knock-down.

In summary, this study identifies TRRAP as a key regulator of p53 levels and links histone-modifying complexes to p53 protein accumulation. Based on the GOF properties of mutp53, this may provide a basis for therapeutic targeting of mutp53 in lymphoma and other cancers.

Translation of abstract (German)

Bei über 40% aller Krebsarten wird der zentrale Tumorsuppressor p53 durch Mutationen inaktiviert. Mutiertes (mut) p53 gewinnt oft neue Eigenschaften („gain-of-function“, GOF), die aktiv zur Tumorentstehung beitragen können. Des Weiteren kann in vielen Tumoren eine massive Akkumulation des mutp53-Proteins beobachtet werden. Dies ist eine Voraussetzung für die GOF-Aktivität, weswegen Tumore häufig auf ein konstitutiv hohes mutp53-Level angewiesen sind. Daher könnte dies für eine gezielte Krebstherapie von Nutzen sein; allerdings sind die Mechanismen der fehlerhaften mutp53-Akkumulation nur unzureichend bekannt. Aus diesem Grund war das Hauptziel dieser Studie, Regulatoren der mutp53-Akkumulation im Burkitt-Lymphom (BL) als Modell für hochaggressiven Krebs zu identifizieren.

Trotz Expression von funktionalem MDM2, dem zentralen negativen Regulator von p53, zeigte sich, dass mutp53 im BL akkumulierte. Um Regulatoren des mutp53-Levels zu identifizieren, wurde ein Durchflusszytometrie-basierter RNA-Interferenz (RNAi) Screen in einem mutp53 BL-Zelllinienmodell durchgeführt. Hierdurch wurde TRRAP (transformation/transcription domain-associated protein) identifiziert, welches ein Bestandteil von vielen Histonacetyltransferasekomplexen ist. In Lymphom- und Kolonkarzinom-Zelllinien mit unterschiedlichen p53-Mutationen verursachten sowohl ein TRRAP Knockdown als auch ein Knockout eine Degradierung von mutp53-Protein (aber nicht mRNA). Im Gegenzug resultierte eine TRRAP-Überexpression in einem erhöhten mutp53-Level. Um den zu Grunde liegenden molekularen Mechanismus zu entschlüsseln, wurde eine massenspektrometrische Analyse der mit mutp53-interagierenden Proteine nach TRRAP Knockdown durchgeführt. Dabei zeigte sich ein Abbau von mutp53 mittels der MDM2-abhängigen physiologischen p53-Degradationsmaschinerie, bestehend aus einem nukleären Export und gefolgt von einer proteasomalen Degradierung. Eine anschließende Genexpressionsanalyse zeigte eine Suppression von Zellzyklusgenen und eine Induktion des Interferon-Signalweges nach TRRAP Knockdown, welches allerdings nicht zur mutp53-Regulation beitrug. Um funktionale Domänen von TRRAP aufzufinden, wurde eine CRISPR/Cas9-basierte Methode („CRISPR Scanning“) angewandt. Dabei wurde eine aus 109 Aminosäuren bestehende Region in der N-terminalen HEAT repeat-Region von TRRAP identifiziert, die eine zentrale Rolle für die mutp53-Stabilisierung und für das Zellüberleben spielte. In BL-Zellen mit Wildtyp-p53 zeigte sich, dass ein TRRAP Knockdown die p53-Stabilisierung und –Aktivität nach genotoxischem Stress beeinträchtigte. Bei einem abschließenden Medikamenten-Screening wurde herausgefunden, dass eine Inhibition von Histondeacetylasen (HDACs) und insbesondere von HDAC1/2/3 den mutp53-Level gleichermaßen beeinträchtigte wie ein TRRAP Knockdown.

Zusammenfassend identifiziert diese Studie TRRAP als einen zentralen Regulator des p53-Levels und verbindet Histon-modifizierende Komplexe mit der Proteinakkumulation von p53. Basierend auf der GOF-Aktivität von mutp53 könnte dies die Basis für eine zielgerichtete Therapie von Lymphomen und weiteren Krebsarten mit mutp53 darstellen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Beckhove, Prof. Dr. Philipp
Date of thesis defense: 9 October 2017
Date Deposited: 09 Nov 2017 10:19
Date: 2017
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
Controlled Keywords: Protein p53, Mutation, Lymphom, RNS-Interferenz, Histon-Acetyltransferase, Histon-Deacetylase
Uncontrolled Keywords: HAT, HDAC, RNAi, TRRAP
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