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A genetically encoded system with high spatio-temporal resolution for in vivo modification of neuronal network activities

Terzi, Firat

German Title: Ein genetisch codiertes System mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zur in vivo Modifikation neuronaler Netwerke

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Abstract

Despite decades of progress in the field of conditional transgene expression, acute, cell-type specific transgene induction remains difficult to achieve with currently available methods. By combining the inducible Tet system with the conditional, cell-type specific Cre recombinase system, I developed a method that allows genetic manipulation of tissues in vivo at cellular resolution based on adeno-associated viruses (AAV). In addition, the Cre-mediated constitutive expression of a fluorescent reporter highlights cells prior to induction of the transgene via the Tet system. Therefore, cells can be carefully characterized before, during, and after genetic manipulation. The phenotypic consequences of transgene expression can thus be temporally correlated in individual cells in vivo. The TetOn system is a two-component system of a Tetracycline-dependent transcriptional activator (rtTA) and the Tet-dependent transgene, which I now flanked by Cre recombinase sites. The TetOn system was optimized to increase tightness by additionally introducing the doxycycline-dependent tTR repressor. In vivo, this substantially reduced the notorious leakiness of the TetOn system. The goal of my thesis research was to use this optimized Cre-dependent TetOn system for acute genetic silencing of neurons in mouse cortex by expression of Kir2.1, a potassium channel that cell-autonomously hyperpolarizes membranes. Co-injection of an AAV with the GFP-based calcium indicator GCamP6 allowed in vivo two-photon imaging the spontaneous activity of the same neurons over time in longitudinal experiments. Injection of doxycycline into the brain induced rapid silencing of neurons within hours that lasted for at least 80 h. Using transgenic Parvalbumin-Cre mice, silencing of inhibitory Parvalbumin interneurons significantly increased the spontaneous activity of surrounding neurons in a distance dependent manner as nearby neurons were more affected. No such effect was seen after silencing a random subpopulation of neurons. Finally, I tested if prolonged silencing influences dendritic morphology. Cre-dependent expression of red fluorescent tdTomato was used to monitor spine numbers before and 75 h after Kir2.1 expression. Corroborating previously published in vitro results, I could show for the first time in vivo that silencing individual neurons after synapse formation does not change spine numbers. This thesis describes the entire journey from the cloning of an optimized TetOn system to its in vivo applications. Together with the establishment of longitudinal in vivo calcium imaging, an analysis pipeline has been created for registration, extracting, and processing of calcium signals for spike estimation. Despite the complexity of the combined tools and the intrinsic variability associated with manipulating and analyzing the same cells over time in vivo, this method yielded exciting data and will provide researchers with the possibility to use this approach in a wide spectrum of experimental settings.

Translation of abstract (German)

Trotz jahrzehntelangen Fortschrittes auf dem Gebiet der konditionalen Genexpression ist die schnelle und zelltypspezifische Transgeninduktion mit den verfügbaren Methoden weiterhin eine große Herausforderung. Durch die Kombination des induzierbaren Tet-Systems mit dem zelltypspezifischen Cre Rekombinase-System habe ich eine Methode entwickelt, die auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) basiert und die genetische Manipulation von Geweben in vivo mit zellulärer Auflösung ermöglicht. Zusätzlich werden Zellen durch Cre vermittelte und konstitutive Expression bereits vor der Transgeninduktion fluoreszenzmarkiert. Dadurch ist es möglich die Zellen vor, während und nach der genetischen Manipulation zu charakterisieren. Die phenotypischen Folgen der Transgenexpression können daher in vivo in einzelnen Zellen über einen langen Zeitraum verfolgt werden. Das TetOn System besteht aus zwei Komponenten: Dem doxycyclinabhängigen transcriptional activator (rtTA) und dem Tet-abhängigen Transgen, welches durch Cre Rekombinase abhängige Sequenzen flankiert wurde. Die unerwünschte basale Expression des TetOn Systems konnte durch die zusätzliche Verwendung des doxycyclinabhängigen tTR Transrepressors weiter verringert werden. Besonders bei in vivo Anwendungen führte dies zu einer substanziellen Verringerung der Hintergrundexpression. Das Ziel dieser Untersuchung war die Benutzung dieses verbesserten TetOn Systems für die schnelle genetische Inaktivierung von Neuronen in der Cortex von Mäusen. Dies wurde erreicht durch die Expression von Kir2.1, einem Kaliumkanal-Protein, das die betroffenen Neuronen hyperpolarisiert und somit deren Aktivität herabreguliert. Die gleichzeitige Injektion von AAV mit GCamP6f, einem GFP-basierten Kalziumsensor, ermöglichte die Aufnahme neuronaler Spontanaktivität mit dem 2-Photonenmikroskop in vivo über einen langen Zeitraum hinweg. Die Injektion von Doxycyclin führte zu einer schnellen Herabregulierung der Aktivität von Neuronen innerhalb von Stunden und hielt für mindestens 80 h an. Durch die Verwendung der Parvalbumin-Cre Mäuselinie konnte gezeigt werden, dass die Herabregulierung der Aktivität von Parvalbumin Interneuronen zu einer erhöhten Spontanaktivität umliegender Neuronen, abhängig von deren Entfernung zu Parvalbumin Interneuronen führt. Solch ein Zusammenhang konnte bei der Herabregulierung einer zufälligen Neuronenpopulation nicht festgestellt werden. Abschließend wurde untersucht, ob die langfristige Herabregulierung neuronaler Aktivität zu morphologischen Veränderungen an Dendriten führt. Die Cre-abhängige Expression von roter tdTomato-Fluoreszenz wurde genutzt, um die Anzahl von Dornfortsätzen vor und 75 h nach der Kir2.1 Expression zu untersuchen. Vormalige in vitro Publikationen bestätigend, konnte ich erstmalig demonstrieren, dass die Anzahl an Dornfortsätzen sich trotz veränderter neuronaler Aktivität in einzelnen, adulten Neuronen nicht ändert. Diese Arbeit beschreibt den gesamten Entstehungsprozess der entwickelten Methode, von der Klonierung des optimierten TetOn Systems bis hin zu seiner Anwendung in vivo. Neben der Etablierung des in vivo calcium imaging wurde zusätzlich eine Analysepipeline für die Registrierung, Extraktion und Verarbeitung der Kalziumsignals zur Abschätzung neuronaler Aktivität entwickelt. Trotz der Komplexität der kombinierten Methoden und der intrinsischen Variabilität, die mit der Manipulation und Analyse von langfristigen in vivo Experimenten einhergeht, konnte ich mit der entwickelten Methode sehr interessante Daten gewinnen. Diese Methode ermöglicht Wissenschaftlern ein breites Spektrum an experimentellen Herangehensweisen, die vorher schwer zugänglich waren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kuner, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 8 March 2018
Date Deposited: 13 Mar 2018 06:36
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Controlled Keywords: Neurobiologie, TetOn System, Networks
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