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Identifizierung und Charakterisierung FAP-spezifischer Liganden für die zielgerichtete Diagnostik und Therapie maligner Tumoren

Loktev, Anastasia

English Title: Identification and characterization of FAP-specific ligands for the targeted diagnosis and therapy of malignant tumors

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Abstract

The identification of novel tumor-specific ligands as transport vehicles for both diagnostic and therapeutic radionuclides represents a major objective in nuclear medical oncology research. The use of selective compounds with high affinity to their target structure results in an increased tumor uptake of the radionuclide, while minimizing undesired radiation exposure of healthy tissue. Based on increasing knowledge about tumor physiology as well as ongoing technological progress, numerous tumor-targeting compounds have been identified and transferred into clinical practice. However, the majority of these compounds comprises antibodies, which feature serious deficiencies, such as poor membrane permeability and tissue penetration, slow clearance and immunogenicity. Peptides, instead, represent a favorable alternative with regard to size, pharmacokinetics and the possibility to be produced cost-effectively in large quantities by automated solid phase synthesis.

Phage display technology represents a powerful tool for the de novo identification of target-specific peptides. This technique is based on the presentation of large polypeptide libraries on the surface of bacteriophages. To this end, the phage genome is manipulated to display the foreign peptides, which are physically linked to their encoding nucleic acids. Following several iterative rounds of incubation with any target protein of interest, the enriched target-specific ligands can therefore be easily identified by DNA sequencing.

Tumor growth and malignancy are not only affected by the characteristics of cancer cells but strongly depend on the attributes of several different cell types within the local tumor microenvironment. Cancer-associated fibroblasts (CAFs) represent an important subpopulation of these stromal cells and are known to promote tumor growth, inflammation and metastasis. They account for a large part of the tumor mass and are genetically more stable and therefore less susceptible to the development of therapy resistance than cancer cells per se. In contrast to normal fibroblasts, CAFs entail a number of tumor-specific marker proteins such as the integral membrane peptidase Fibroblast Activation Protein (FAP). This protein is highly expressed in the microenvironment of more than 90% of epithelial tumors including breast, lung and pancreatic carcinoma. Overexpression of FAP is associated with a poor prognosis in a wide range of different cancers. Due to very low expression levels in normal tissues, FAP represents an attractive molecular target for the development of tumor-specific diagnostics and therapies.

To identify novel FAP-specific peptides using phage display, two combinatorial libraries based on the scaffold structures Sunflower Trypsin Inhibitor-1 (SFTI-1) and Min-23 were built. They comprise a cyclic, disulfide-bridged backbone and a variable sequence consisting of six to ten random amino acids. After incubation of the libraries with the target protein in four rounds of biopanning, the FAP-specific ligands were isolated and their sequence determined using next-generation sequencing. A selection of suitable peptides was synthesized by solid phase synthesis, purified and characterized in different cell-based radioligand assays.

In contrast to the SFTI-1 based biopanning, which did not lead to any enrichment of FAP-specific peptides, the use of the Min-23 library was successful in identifying several FAP-targeting ligands. However, these peptides showed a very low affinity to their target protein, which most likely results from a rapid degradation. It is conceivable that the enzymatic function of the membrane protein effectuates a rapid hydrolysation of the small peptides upon initial binding. A solution to this is the use of an alternative scaffold, which impedes enzymatic cleavage or ensures cell internalization after hydrolysation.

In this context, the cyclotide-based FAP-specific miniprotein MC-FA-012, identified by BionTech AG, was characterized regarding target affinity, specificity and pharmacokinetic profile in radioligand binding assays as well as in FAP-positive tumor-bearing mice. In contrast to the Min-23-based peptides, MC-FA-012 and its trimerized version DOTA-(MC-FA-012)3 demonstrated high affinity to human FAP, while no substantial binding to the structurally related protein CD26 was observed. In addition, DOTA-(MC-FA-012)3 rapidly accumulated in FAP-positive tumor xenografts in vivo and showed negligibly low unspecific binding in healthy tissue, except for the kidneys. A first clinical analysis of the radiolabeled compound in patients with metastatic pancreatic carcinoma revealed a robust accumulation of the tracer in the primary tumor as well as in lymph node and bone metastases. In contrast, tracer uptake into normal tissue was very low. The radioactivity was cleared rapidly from the blood stream and excreted predominantly via the kidneys, resulting in high contrast PET images.

Since the high accumulation of DOTA-(MC-FA-012)3 in the kidneys could not be sufficiently reduced by different competition strategies, further development of the radiotracer regarding a potential therapeutic application was not pursued. The investigation of the structure-activity relations of MC-FA-012 revealed that both the scaffold and certain functional groups within the FAP-specific binding sequence account for high FAP affinity. Introducing even minor changes in the molecule's conformation resulted in an almost complete loss of binding.

Consequently, a different approach towards the development of a FAP-specific compound was adopted by designing the small molecules FAPI-01 to FAPI-15 based on a potent FAP inhibitor. Each of the compounds demonstrated high specific binding to human and murine FAP and internalized rapidly into FAP-expressing cells. Imaging and biodistribution studies in xenotransplanted mice proved a rapid tumor uptake of the tracers in a genetically modified FAP-overexpressing tumor model as well as in human FAP-negative tumors due to endogenous murine FAP expression. Notably, the radiotracers demonstrated rapid renal clearance without substantial binding to non-cancerous tissue. Due to their advantageous pharmacokinetics and an excellent stability in human serum, the compounds FAPI-02 and FAPI-04 were selected for further clinical investigation. Using PET/CT, biodistribution of the radiotracers was analyzed in patients with metastasized epithelial cancers, including breast, lung, pancreatic and colon carcinoma as well as in high-grade glioblastomas. Both tracers rapidly accumulated in the primary tumor as well as in soft tissue, lymph node and bone metastases. In contrast, tracer uptake into normal tissue was very low, resulting in favorable tumor-to-organ ratios and high contrast images.

Comparative imaging in one patient with locally advanced lung adenocarcinoma revealed an obvious advantage of FAPI-02 compared to the commonly used PET tracer 18F-FDG. FAPI-02 showed a higher tumor uptake and significantly lower activities in blood and liver, resulting in higher image contrast with better visibility of metastatic lesions. In contrast to FDG, which highly accumulates in cells with high glucose consumption, e.g. the brain or inflammatory tissue, FAPI-02 selectively targets FAP-expressing carcinomatous lesions. This opens up new perspectives for the precise diagnosis of malignant lesions in tissues with high metabolic activity, such as liver or brain.

Furthermore, various approaches for a potential therapeutic application of the FAP-ligands are currently being investigated, including different radionuclides and alternative effector molecules, such as chemotherapeutics or immunomodulators. Given the possibility to use either diagnostic or therapeutic nuclides with the same molecule, FAPI-02 allows simple stratification of patient cohorts likely to benefit from a therapeutic intervention.

Translation of abstract (German)

Die Identifizierung neuer tumorspezifischer Liganden für den Transport von diagnostischen und therapeutischen Radionukliden ist ein wichtiges Ziel der nuklearmedizinisch-onkologischen Forschung. Durch den Einsatz selektiver Verbindungen mit hoher Affinität zur adressierten Zielstruktur soll die Aufnahme des Radiopharmakons in den Tumor erhöht und eine unnötige Strahlenbelastung von gesundem Gewebe minimiert werden. Dank zunehmender Erkenntnisse über die Physiologie von Tumoren sowie kontinuierlich verbesserter technischer Möglichkeiten konnten bereits zahlreiche zielgerichtete Liganden identifiziert werden. Bei dem Großteil dieser Verbindungen handelt es sich um Antikörper, die aufgrund ihrer Größe und ihrer Immunogenität jedoch auch einige Nachteile mit sich bringen. Im Gegensatz dazu stellt der Einsatz von Peptiden hinsichtlich Größe, Membranpermeabilität und Pharmakokinetik eine sinnvolle Alternative dar.

Eine Möglichkeit für die Identifizierung neuer Peptidliganden ist das Screening rekombinanter Bibliotheken im Phagen-Display. Dieses biotechnologische Verfahren beruht auf der Präsentation beliebiger Polypeptide an der Oberfläche von Bakteriophagen, deren Genom die für die Peptide kodierende DNA enthält. Während einer Inkubation der Phagenbibliothek mit dem Zielprotein über mehrere Runden, dem sogenannten Biopanning, erfolgt eine Anreicherung der Target-affinen Peptide, deren Primärstruktur durch die Sequenzierung der korrespondierenden DNA ermittelt werden kann.

Das Wachstum und die Metastasierung maligner Neoplasien sind nicht nur auf die Eigenschaften der Tumorzellen zurückzuführen, sondern werden erst durch eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen im Tumorstroma ermöglicht. Hierzu gehören auch die Tumorassoziierten Fibroblasten (CAFs), die in unterschiedlichen Tumorarten nachgewiesen werden können und eine wichtige Rolle für das Wachstum, die Progression sowie die Migration maligner Neoplasien spielen. Sie bilden einen Großteil des Tumorstromas und sind genetisch deutlich stabiler und somit weniger anfällig für die Entwicklung einer Therapieresistenz als Tumorzellen selbst. Im Gegensatz zu normalen Fibroblasten exprimieren CAFs eine Reihe von tumorspezifischen Oberflächenproteinen, wie das Fibroblast Activation Protein (FAP), eine membranständige Serinprotease, deren hohe intratumorale Expression mit einer schlechten Tumorprognose assoziiert wird. Indessen kann das Protein in benignen Läsionen oder gesundem adultem Gewebe nicht nachgewiesen werden, was es zu einer idealen Zielstruktur für die Entwicklung zielgerichteter Verbindungen für die Tumordiagnostik und -therapie macht.

Für die Identifizierung neuer peptidischer FAP-Liganden mit Hilfe der Phagen-Display- Technologie wurden kombinatorische Bibliotheken eingesetzt, bei welchen sechs bis zehn variable Aminosäuren in eine Gerüststruktur, ein sogenanntes Scaffold, eingebunden sind. Hierfür wurden die zyklischen, durch Disulfidbrücken stabilisierten Peptide Sunflower Trypsin Inhibitor-1 (SFTI-1) und Min-23 verwendet. Nach Inkubation der Bibliotheken mit dem Zielprotein über vier Runden wurden die FAP-spezifischen Binder isoliert und deren Peptidsequenz mittels Next Generation Sequencing bestimmt. Eine geeignete Auswahl der angereicherten Peptide wurde mittels Festphasensynthese und anschließender Oxidation in Lösung hergestellt und nach radioaktiver Markierung im Zellbindungsassay hinsichtlich Targetaffinität und -spezifität charakterisiert. Im Gegensatz zum Biopanning mit der SFTI-1-Bibliothek, welches zu keiner Anreicherung FAP-spezifischer Peptide führte, gelang es mit Hilfe der Min-23-Bibliothek, mehrere Target-spezifische Binder zu identifizieren, deren Affinität gegenüber dem Zielprotein jedoch sehr gering war. Eine mögliche Erklärung hierfür liegt in einer unzureichenden Stabilität der Liganden, welche aufgrund der enzymatischen Funktion des Membranproteins nach initialer Bindung rasch hydrolysiert werden. Dieses Problem könnte durch den Einsatz eines alternativen Scaffolds umgangen werden, welches nicht enzymatisch gespalten wird bzw. auch nach hydrolytischer Spaltung eine ausreichend hohe Internalisierung des Liganden in die Zelle ermöglicht.

Vor diesem Hintergrund wurde der von BionTech AG entwickelte cyclotidische FAP-Ligand MC-FA-012 hinsichtlich Targetaffinität und -spezifität in Zellbindungs- sowie Organverteilungsstudien in tumortragenden Mäusen charakterisiert. Im Gegensatz zu den kleineren Min-23-Peptiden zeigte MC-FA-012 und seine trimerisierte Variante DOTA-(MC-FA-012)3 eine deutlich höhere Bindung an humanes FAP, wobei die Bindung an das strukturell verwandte Membranprotein CD26 vernachlässigbar gering war. Darüber hinaus reicherte sich DOTA-(MC-FA-012)3 rasch in FAP-positiven Tumoren im Tiermodell an und zeigte keine unspezifische Bindung in gesundem Gewebe, mit Ausnahme der Niere. Auch eine erste klinische Untersuchung von Patienten mit metastasiertem Pankreaskarzinom unter Verwendung der radiomarkierten Substanz lieferte vergleichbare Ergebnisse und diagnostische PET-Bilder mit einem ausgezeichneten Bildkontrast. Aufgrund einer hohen Akkumulation der Substanz in der Niere, die durch unterschiedliche Kompetitionsstrategien bislang nicht ausreichend reduziert werden konnte, wurde eine weitere Entwicklung des Radiotracers im Hinblick auf eine potentielle therapeutische Anwendung nicht weiter verfolgt. Die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von MC-FA-012 zeigte, dass sowohl das Scaffold als auch bestimmte funktionelle Gruppen innerhalb der FAP-spezifischen Bindesequenz für die hohe FAP-Bindung verantwortlich sind. Selbst eine minimale Veränderung der Konformation des Moleküls resultierte in einem nahezu vollständigen Bindungsverlust.

Weiterhin wurden, ausgehend von einem selektiven FAP-Inhibitor, die FAP-spezifischen Tracer FAPI-01 bis FAPI-15 entwickelt und in Zellbindungsstudien sowie im Tiermodell charakterisiert. Alle Verbindungen zeigten eine hohe und spezifische Bindung an humanes und murines FAP in vitro und internalisierten nahezu vollständig in FAP-positive Zellen. Bildgebungs- und Bioverteilungsstudien in tumortragenden Mäusen demonstrierten eine schnelle Tumoraufnahme der Tracer, keine unspezifische Bindung in gesundem Gewebe sowie eine rasche renale Clearance. Dabei akkumulierten die Tracer sowohl in einem gentechnisch modifizierten Tumormodel, das sich durch eine Überexpression des humanen Proteins auszeichnet, als auch in ursprünglich FAP-negativen Xenotransplantaten, was auf eine Bindung des Liganden an endogenes murines FAP zurückzuführen ist. Aufgrund ihrer vorteilhaften Pharmakokinetik sowie einer hohen Stabilität in humanem Serum wurden FAPI-02 und FAPI-04 in einer ersten klinischen Studie untersucht. Hierfür wurde die Bioverteilung der radiomarkierten Tracer in Patienten mit diversen epithelialen Tumoren, u.a. Brust-, Lungen-, Pankreas- und Kolonkarzinom, mittels PET analysiert. Beide Tracer akkumulierten schnell im Primärtumor sowie in Weichteil-, Lymphknoten- und Knochenmetastasen, jedoch nicht in gesundem Gewebe, was zu einer vorteilhaften Tumor-Organverteilung führte. Im Vergleich zu dem nuklearmedizinischen Standarddiagnostikum 18F-FDG zeigte FAPI-02 bei einem Patienten mit einem metastasierten Lungentumor eine höhere Tumoraufnahme und eine deutlich geringere Aktivität im Blut und in der Leber. Dies resultierte in einem höheren Bildkontrast und einer besseren Darstellung der malignen Läsionen. Im Gegensatz zum Glucose-basierten Radiotracer, welcher in Organen mit einem physiologisch hohen Energieumsatz sowie in entzündlichem Gewebe eine starke Anreicherung zeigt, akkumulierte FAPI-02 lediglich in den karzinomatösen Läsionen, die das Zielprotein exprimieren. Dies eröffnet neue Perspektiven für die zielgerichtete Diagnose von malignen Läsionen in Geweben mit hoher metabolischer Aktivität, wie der Leber oder dem Gehirn. Darüber hinaus werden derzeit verschiedene Ansätze für eine therapeutische Anwendung des FAP-Liganden untersucht. Hierzu gehört eine Kopplung des FAP-affinen Strukturelementes mit therapeutisch wirksamen Radionukliden sowie alternativen Effektormolekülen, wie z.B. Chemotherapeutika oder Immunmodulatoren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Mier, Prof. Dr. Walter
Date of thesis defense: 5 July 2018
Date Deposited: 26 Jul 2018 11:35
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Medizinische Fakultät Heidelberg > Radiologische Universitätsklinik
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
610 Medical sciences Medicine
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