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Inducing and suppressing the alternative lengthening of telomeres mechanism in cancer cells

Braun, Delia

German Title: Induzierung und Suppression des alternativen Telomerverlängerungs-Mechanismus in Krebszellen

[img] PDF, English
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Abstract

Cancer cells extend critically short telomeres either by reactivating the reverse transcriptase telomerase or by employing alternative lengthening of telomeres (ALT). The ALT mechanism depends on proteins involved in DNA repair and homologous recombination (HR). High-throughput sequencing is increasingly used to analyze whole genome sequences (WGS) and gene expression in patient samples, and potentially, provides a rich resource of information on ALT. However, in ALT cancers the only recurrent mutations identified so far are in the chromatin remodeler ATRX (alpha thalassemia/ mental retardation syndrome X-linked), the histone chaperone DAXX (death domain associated protein), and the histone variant H3.3. In addition, gene expression signatures for patient stratification into ALTpositive and ALT-negative as well as a systematic approach to identify genes involved in telomere maintenance (TM) and in particular ALT via functional annotation are currently missing. One wellestablished hallmark of ALT is the dislocation of the PML (promyelocytic leukemia) protein to telomeres in ALT-associated PML nuclear bodies (APBs). These colocalizations are reliable biomarkers for ALT-positive tumors, but the functional role of PML during the development of ALT remains elusive. In this thesis, I have addressed the issues raised above by work in three areas: First, the TelNet database was developed as a comprehensive compilation of TM genes. Proteins involved in TM were collected, functionally categorized, and evaluated by applying a significance score. In addition to various search modes, a statistics page was implemented for TM pathway analysis and for prediction of the active TM mechanism (TMM). Second, ALT candidate genes were identified by gene expression analysis using four different approaches and isogenic cellular systems: (i) ALT suppression by HDAC inhibitor SAHA in U2OS cells, (ii) ALT induction by ASF1 depletion in HeLa cells with long telomeres (LT), (iii) reduced ALT induction capacity of the ASF1 depletion in HeLa LT cells by SAHA treatment, and (iv) deletion of EST2 (ever shorter telomeres 2), the telomerase protein subunit, in budding yeast to generate survivors that maintain telomeres by type II recombination, equivalent to the human ALT mechanism. A differential gene expression analysis comparing perturbed cells with the unperturbed control cells revealed a positive correlation of WNT and TGFb signaling with the presence of ALT and on the other hand a negative association of TNF/ NFkB/ MAP kinase signaling. Furthermore, a role as potential ALT enhancers was predicted for KCTD15 and TNNC1. In budding yeast type II survivors, approximately 30 genes showed a relatively small albeit statistically significant change in gene expression as compared to pre-senescent cells. Genes within the iron-regulon were overrepresented among downregulated genes, including FIT1, FIT2, ARN2, and FRE4, indicating stress response. Third, I investigated the functional role of PML in the ALT pathway by recruiting PML to telomeres in cells with and without ALT background. The formation of artificial APBs induced telomere clustering and subsequently increased the abundance of extrachromosomal repeats as an ALT feature in both ALT-positive and ALT-negative cells. The results obtained in this thesis facilitate patient stratification based on deep sequencing data according to their TM mechanism and provide a better understanding of the functional role of APBs for ALT.

Translation of abstract (German)

Krebszellen verlängern kritisch kurze Telomere entweder durch Reaktivierung der reversen Transkriptase Telomerase oder durch alternative Telomerverlängerung (ALT). Der ALT-Mechanismus hängt von Proteinen ab, die an der DNA-Reparatur und der homologen Rekombination (HR) beteiligt sind. Die Hochdurchsatzsequenzierung wird zunehmend zur Analyse der Genomsequenz und Genexpression in Patientenproben verwendet und bietet möglicherweise eine reichhaltige Informationsquelle über ALT. Bei ALT-Karzinomen wurden bisher nur rekurrente Mutationen in den Genen des Chromatin-modellierenden Faktors ATRX, des Histon-Chaperons DAXX und der Histonvariante H3.3 identifiziert. Darüber hinaus fehlen derzeit Genexpressionssignaturen für die Stratifizierung von Patienten in ALT-positive und ALT-negative Patientengruppen. Weiterhin mangelt es an einem systematischen Ansatz zur Identifizierung von an der Telomer-Erhaltung und insbesondere an ALT beteiligten Genen mittels funktioneller Annotation. Ein bekanntes Merkmal von ALT ist die Dislokation des PML-Proteins an Telomere in ALT-assoziierten PML-Kernkörpern (APBs). Diese Kolokalisationen sind zuverlässige Biomarker für ALT-positive Tumore, aber die funktionelle Rolle von PML während der Entwicklung von ALT ist nicht bekannt. In dieser Arbeit habe ich die oben genannten Inhalte durch Arbeiten in drei Abschnitten behandelt: Zuerst wurde die TelNet-Datenbank als umfassende Zusammenstellung von TM-Genen entwickelt. Proteine, die an der Erhaltung der Telomere beteiligt sind, wurden gesammelt, funktional kategorisiert und mit einem Signifikanzwert bewertet. Zusätzlich zu verschiedenen Suchmodi wurde eine Statistikseite für die TM-Analyse und für die Vorhersage des aktiven Telomer-Erhaltungsmechanismus implementiert. Zweitens wurden ALTKandidatengene durch Genexpressionsanalyse unter Verwendung von vier verschiedenen Ansätzen und isogenen zellulären Systemen identifiziert: (i) ALT - Suppression durch den Histondeacetylase Inhibitor SAHA in U2OS-Zellen, (ii) ALT-Induktion durch ASF1-Depletion in HeLa-Zellen mit langen Telomeren (LT), (iii) reduzierte ALT-Induktionskapazität der ASF1-Depletion in HeLa-LT-Zellen durch SAHA-Behandlung und (iv) Deletion von katalytischen Telomerase-Einheit EST2 in Hefe, um Hefezellen zu erhalten, die Telomere mithilfe von Rekombination erhalten, äquivalent zum humanen ALT Mechanismus. Eine differentielle Genexpressionsanalyse ergab eine positive Korrelation des WNT und TGFb Signalwegs und auf der anderen Seite eine negative Korrelation des TNF/ NFkB/ MAP Kinase Signalwegs mit aktivem ALT Mechanismus. Darüber hinaus wurden KCTD15 und TNNC1 als potentielle ALT-Gene vorhergesagt. Bei ALT-Hefezellen zeigten ca. 30 Gene eine relativ geringe, wenn auch statistisch signifikante Veränderung der Genexpression im Vergleich zu pre-seneszenten Zellen. Herunterreguliert waren Gene des Eisen-Regulons, einschließlich FIT1, FIT2, ARN2 und FRE4, was auf eine Stressreaktion hinweisen könnte. Drittens untersuchte ich die funktionelle Rolle von PML im ALT Mechanismus durch Rekrutierung von PML zu Telomeren in Zellen mit und ohne aktiven ALTMechanismus. Die Bildung von künstlichen APBs induzierte eine Ansammlung von Telomeren und erhöhte anschließend die Menge an extrachromosomalen Telomersequenzen sowohl in ALT-positiven als auch in ALT-negativen Zellen. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse erleichtern die Stratifizierung von Patienten basierend auf Transkriptomsequenzierungsdaten gemäß ihrem TMMechanismus und ermöglichen ein besseres Verständnis der funktionellen Rolle von APBs für ALT.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Rippe, Prof. Dr. Karsten
Date of thesis defense: 24 July 2018
Date Deposited: 23 Nov 2018 08:31
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
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