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Impact of nucleotide modifications on immune stimulatory effects of RNA

Freund, Isabel

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Abstract

Posttranscriptional RNA modifications are an important feature of self/non-self discrimination of nucleic acids by the innate immune system. Ribose 2’-O-methylation within RNA has been shown to limit recognition by Toll-like receptors (TLR) 7 and TLR8. In the natural RNA context, 2’-O-methylation of guanosine at position 18 (Gm18) within transfer RNAs (tRNAs) was identified to abolish RNA induced immune activation. However, the exact requirement of Gm18 within tRNA for affecting TLR responses remained unknown. Moreover, whether Gm18 plays a role as immune modulatory RNA modification in physiological settings or has different roles in pro- vs. eukaryotes was unexplored. Finally, preliminary data suggested the existence of further RNA modifications that affect immune recognition. This thesis therefore aimed to explore the function of Gm18 for immune regulation in more detail and to study further RNA modifications for immune regulatory properties. In a combined chemical-immunological approach on human tRNALys3 which showed no TLR7 activation but lacked Gm18, this work identified a new immune-silencing modification: Tm, a double-methylation of uridine, at position 54 of human tRNAs was sufficient to decrease immune stimulation of TLR7. However, in contrast to Gm18, the effects were not dominant negative in co-stimulation experiments. Thus, for the first time an immune silencing modification in a natural RNA context has been deciphered. To further define the inhibition of TLR7 and TLR8 activation by Gm18 modified RNA, a systematic variation of nucleotides within a conserved tRNA sequence was performed. The studies allowed identification of an optimized sequence motif antagonizing TLR7/8 responses. The minimal, naturally occurring GmGC tri-nucleotide motif within a 9-mer oligoribonucleotide was identified as most efficient to antagonize recognition of otherwise immune stimulatory RNA. The findings could be beneficial to design immune inhibitory oligoribonucleotides as therapeutic approach in autoimmune diseases associated with exaggerated TLR7/8 activation. In further series of experiments mutants lacking Gm18 modification in either bacterial or eukaryotic tRNA were used to study the functional impact on overall immune stimulation. tRNA from an Escherichia coli (E.coli) mutant lacking the enzyme trmH that incorporates Gm18 showed increased immune stimulation. However, stimulation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and TLR8 deficient genetically engineered monocyte/macrophage–like BlaER1 cells, with whole E.coli wild-type and trmH deficient bacteria revealed RNA dependent recognition of E. coli but negligible effects of Gm18. Interestingly, results indicate that trmH mediated Gm18 modification might be subject to regulation under stress conditions. Similarly, CRISPR/Cas9 generated knockouts of TARBP1, the Gm18 methyltransferase in human cells, showed slightly increased immunostimulation for tRNA fractions but no change for whole RNA stimulation. In summary, RNA 2’-O-methyl modification within tRNA is capable to limit immune recognition by TLR7/8, yet for manipulation of the overall immune recognition of bacterial or eukaryotic RNA the identified modifications alone seem to be insufficient.

Translation of abstract (German)

Posttranskriptionale Modifikationen von RNA sind ein wichtiger Aspekt der selbst/fremd-Unterscheidung von Nukleinsäuren durch das angeborene Immunsystem. Eine übergeordnete Rolle in der Erkennung von RNA spielt die 2‘-O-Methylierung von einzelsträngiger RNA (ssRNA), da diese Art der Modifikation die Aktivierung der Toll-ähnlicher Rezeptoren (TLR) 7 und TLR8 inhibieren kann. Erforscht wurde dieser Effekt im natürlichen Kontext bakterieller tRNAs, welche eine 2‘-O-Methylierung am Guanosin an Position 18 (Gm18) aufwiesen. Jedoch war der Einfluss von Gm18 in prokaryotischer oder eukaryotischer tRNA im physiologischen Kontext auf die Immunerkennung nicht bekannt. Zudem gaben unveröffentlichte Daten Hinweise auf weitere RNA Modifikationen, die die Immunostimulation beeinflussen können. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung von Gm18 für die Aktivierung des Immunsystems besser zu charakterisieren und weitere, neue immunmodulatorische RNA Modifikationen zu identifizieren. In einem chemisch-immunologischen Ansatz wurde die native tRNALys3 untersucht, welche zwar keine Immunstimulation von TLR7 zeigte, jedoch nicht antagonisierend auf den Rezeptor wirkte. Tm, eine natürlich vorkommende Doppelmethylierung von Uridin an Position 54 in humanen tRNAs wurde als immunmodulatorische Modifikation identifiziert. Dabei bewirkte eine 2‘-O-Methylierung von RNA zum ersten Mal eine Stummschaltung der RNA Erkennung über TLR7 ohne dessen zusätzliche Antagonisierung. Um die Inhibition von TLR7 und TLR8 durch Gm18 besser charakterisieren zu können, wurden einzelne Nukleobasen einer konservierten tRNA Sequenz systematisch verändert. Dabei konnte ein optimiertes Sequenzmotiv identifiziert werden, welches eine TLR7- und TLR8-Stimulation inhibiert. Das natürlich vorkommende, drei Nukleotid lange GmGC Motiv als Teil eines 9-mer Oligoribonukleotids, war am effizientesten um die Immunaktivierung durch stimulative RNA zu antagonisieren. Die Identifikation eines neuen Sequenzmotives zur Unterdrückung der RNA-Erkennung ist ein wichtiger Aspekt zur Gestaltung von inhibitorischen Oligoribonukleotiden für therapeutische Anwendungen die mit einer erhöhten TLR7/8 Aktivierung einhergehen. In einer weiteren Versuchsreihe zur Untersuchung der physiologischen Relevanz von Gm18 wurden bakterielle und eukaryotische Mutanten verwendet, die kein funktionelles Enzym zur 2’-O-Methylierung von tRNAs an Position 18 aufwiesen. tRNAs isoliert aus E. coli die defizient für eben das Enzym trmH waren, zeigten einen Anstieg in der Immunstimulation. Die Infektion von humanen peripheren mononuklearen Blutzellen und TLR8 defizienten BlaER1 Zellen, einer Monozyten/Makrophagen-ähnlichen Zelllinie, mit lebenden E. coli Bakterien ergab eine RNA abhängige Erkennung dieser Bakterien, welche jedoch nicht durch die 2‘-O-Methylierung von G18 beeinflusst wurde. Interessanterweise deuteten diese Infektionsversuche auf eine stressinduzierte Regulation der 2‘-O-Methylierung hin. Isolierte tRNAs aus humane Zellen, die durch CRISPR/Cas9 Technologie defizient für die tRNA 2‘-O-Methyltransferase TARBP1 waren, zeigten ebenfalls einen leichten Anstieg in der Immunstimulation. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die RNA-Erkennung durch TLR7 und TLR8 durch 2‘-O-Methylierung von tRNA inhibiert werden kann. Jedoch, basierend auf den neusten Daten, ist die 2‘-O-Methylierung von tRNAs nicht ausreichend um die Erkennung von lebenden Bakterien durch das angeborene Immunsystem zu beeinflussen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bartenschlager, Prof. Dr. Ralf
Date of thesis defense: 26 November 2018
Date Deposited: 06 Dec 2018 12:55
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Innate immune system, Pattern recognition receptors, RNA modifications, Toll-like receptors
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