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The function of the lipid phosphatase MTMR7 in anti-EGFR therapy resistance of colorectal cancer (CRC)

Söhn, Michaela

German Title: Die Funktion der Lipidphosphatase MTMR7 in der anti-EGFR Therapieresistenz des kolorektalen Karzinoms

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Abstract

Colorectal cancer (CRC) is one of the most common types of cancer worldwide. The most important difficulty of treating this type of cancer, is the intrinsic and/or acquired resistance to chemotherapeutic drugs or targeted therapies. This unresponsiveness is often due to mutations in the KRAS gene, leading to constitutive activation of the RAS signaling pathway and in turn to the proliferation and survival of the tumor cells. The expression of the peroxisome proliferator activated-receptor (PPARγ) is correlated with a good prognosis in CRC patients and it is one of the candidates to inhibit RAS through the upregulation of Ras-inhibitory proteins like PTEN, DOK1 or Caveolin-1. In this thesis, the relationship between PPARγ and its new binding partner, myotubularin-related protein 7 (MTMR7), was evaluated concerning its inhibitory effect on RAS signaling. The interaction of the two proteins in the cytosol of colorectal cancer cell lines could be verified using coimmunoprecipitation, proximity ligation assay as well as immunofluorescence co-staining. Furthermore, the expression of PPARγ target genes like TFF3 were upregulated and PPARγ- responsive-element (PPRE) activity significantly enhanced upon MTMR7 transfection. In contrast, subcellular fractionation revealed no influence of MTMR7 on PPARγ localization. This positive influence of MTMR7 on PPARγ activity was then further elucidated by assessing the impact of MTMR7 overexpression on RAS signaling. Notably, MTMR7 reduced active RAS as well as total protein levels of RAS. This effect could not be prevented by using proteasomal/lysosomal inhibitors (MG132/Chloroquine). Treating the cells with KCl facilitated RAS reduction, whereas amiloride, an epithelial sodium channel blocker prevented its reduction. Studying the effect of MTMR7 on therapy resistance indicated that a combination therapy using everolimus and sorafenib could not substitute for MTMR7 in vitro. Treating the cells with a MTMR7-peptide, though, reduced cell proliferation significantly. Further investigation of the MTMR7-peptide showed that it is capable to reduce serum response element activation and displayed a tendency of RAS-inhibition. Conclusively, the tumor suppressor MTMR7 promotes RAS down-regulation, which leads to a reduced ERK 1/2 activation and a transcriptional activation of the nuclear receptor PPARγ. This in turn results in the activation of tumor suppressor genes like CAV1, DOK1 or PTEN. Thus, the MTMR7-PPARγ crosstalk might be a new target for the treatment of colorectal cancer, where mutant KRAS leads to treatment failure of EGFR therapy.

Translation of abstract (German)

Dickdarmkrebs ist eine der häufigsten Tumorerkrankungen weltweit. Die größte Schwierigkeit bei der Behandlung dieser Art von Tumoren ist die intrinsische und / oder erworbene Resistenz gegen Chemotherapeutika oder gezielte Therapien. Dieser mangelnde Therapieerfolg ist oft auf Mutationen im KRAS-Gen zurückzuführen, die zur dauerhaften Aktivierung des RAS Signalweges und damit zur unkontrollierten Proliferation und zum Überleben der Tumorzellen führen. Die Expression des Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptors gamma (PPARγ) korreliert mit einer guten Prognose bei Patienten mit kolorektalem Karzinom und kann durch die Aktivierung von RAS inhibitorischen Proteinen, wie beispielsweise PTEN, DOK1 oder Caveolin-1 eine Hemmung der RAS-Aktivität hervorrufen. In dieser Arbeit wurde die Beziehung zwischen PPARγ und seinem neuen Bindungspartner, dem Myotubularin-verwandten Protein 7 (MTMR7), hinsichtlich seiner hemmenden Wirkung auf den RAS-Signalweg untersucht. Die Interaktion der beiden Proteine im Zytosol von kolorektalen Karzinomzelllinien konnte durch Co-Immunopräzipitation, „Proximity Ligation Assay“ sowie Immunfluoreszenz-Co-Färbung verifiziert werden. Darüber hinaus konnte als Folge der Transfektion des MTMR7 Plasmids eine erhöhte Expression von PPARγ-Zielgenen, wie TFF3, sowie eine erhöhte transkriptionelle Aktivität von PPARγ festgestellt werden. Im Gegensatz dazu zeigte die subzelluläre Fraktionierung keinen Einfluss von MTMR7 auf die PPARγ-Lokalisation. Dieser positive Einfluss von MTMR7 auf die PPARγ-Aktivität wurde anschließend näher differenziert, indem der Einfluss der MTMR7-Überexpression auf den RAS-Signalweg untersucht wurde. Bemerkenswerterweise reduzierte MTMR7 sowohl das aktive RAS als auch den Gesamtproteingehalt von RAS. Dieser Effekt konnte durch proteasomale / lysosomale Inhibitoren (MG132 / Chloroquin) nicht verhindert werden. Die Behandlung der Zellen mit KCl verstärkte sogar die Abnahme des RAS Proteingehalts, während Amilorid, ein epithelialer Natriumkanalblocker, diese Abnahme des RAS Proteins verhinderte. Die Untersuchung der Wirkung von MTMR7 auf die Therapie-Resistenz zeigte, dass eine Kombinationstherapie mit Everolimus und Sorafenib die Lipidphosphatase nicht ersetzen konnte. Die Behandlung der Zellen mit einem MTMR7-Peptid verringerte jedoch die Zellproliferation signifikant. Eine weitere Untersuchung des MTMR7-Peptids zeigte, dass es in der Lage ist, die Aktivierung des „Serum-Response-Elements“ zu reduzieren, und dass es eine Tendenz zur RASInhibierung besitzt. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der Tumorsuppressor MTMR7 die Abnahme des RAS Proteingehalts fördert, was zu einer geringeren ERK1/2-Aktivität führt und als Folge die transkriptionelle Aktivität des nukleären Rezeptors, PPARγ, erhöht. Dies wiederum führt zu einer Aktivierung von Tumorsuppressorgenen wie CAV-1, DOK1 oder PTEN. Daher könnte die MTMR7-PPARγ-Interaktion ein neues Ziel für die Behandlung von kolorektalen Karzinomen darstellen, bei denen mutiertes KRAS zu einem Therapieversagen der EGFR Therapie führt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wölfl, Prof. Dr. Stefan
Date of thesis defense: 28 November 2018
Date Deposited: 11 Dec 2018 13:51
Date: 2018
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 000 Generalities, Science
Controlled Keywords: Kolorektales Karzinom, K-RAS, MTMR7
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