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Thrombozyten CD40-Ligand induzierte Endothelzellen-Monozyten Interaktion an Prädilektionsstellen für die Atherosklerose

Lont, Sebastian Alexander

English Title: Thrombocyte CD40-ligand induced endothelial cell-monocyte interaction at atherosclerosis predilection sites

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PDF, German
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Abstract

Durch die gesteigerte Lebenserwartung in Industrienationen werden in fortgeschrittenem Alter auftretende Krankheiten wie die koronare Herzkrankheit immer prävalenter. Ihr zugrunde liegt die Atherosklerose, bei der die Rekrutierung von Monozyten an Prädilektionsstellen für die Entstehung von atherosklerotischen Plaques, z.B. an Gefäßbiegungen und -verzweigungen, zu einer zunehmenden Stenosierung des Gefäßlumens führt. Sowohl bei der Monozytenrekrutierung als auch bei der in der Gefäßwand auftretenden Entzündung spielen CD40-Rezeptor- und CD40-Ligand-Interaktionen eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wird deshalb der Frage nachgegangen, ob eine vermehrte endotheliale CD40-Expression an den Atherosklerose-Prädilektionsstellen für die Rekrutierung und Aktivierung von Monozyten in der Frühphase der Atherosklerose verantwortlich ist. Hierfür wurde zunächst eine ApoE-Knockout-Mauslinie mit Tamoxifeninduzierter Depletion von endothelialem CD40 generiert, bei der das Voranschreiten der Plaqueentwicklung in der Frühphase der Atherosklerose mittels Ultraschallbildgebung und Oil Red O-Färbung quantifiziert werden sollte. Aufgrund der fehlenden Verifizierbarkeit des endothelialen CD40-Knockout wurde mit einem humanen in vitro-Modell der Gefäßverzweigung, dem ibidi Y-Slide, das Adhäsionsverhalten von fluoreszenzfarbstoffgefärbten Monozyten an Endothelzellen via Thrombozyten-besetzten ultra-langen von-WillebrandFaktor (ULVWF)-Multimeren mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Dabei wurde nach Zugabe von löslichem sCD40-Ligand (sCD40L) eine signifikante Zunahme der ULVWF-Multimer-Freisetzung und Monozytenadhäsion im Bereich der Verzweigung festgestellt. Diese Ergebnisse konnten in einem neuartigen murinen ex vivo-Perfusionsmodell der A. carotis Verzweigung reproduziert werden. Dazu wurden isolierte und fluoreszenzfarbstoffgefärbte murine Monozyten und Thrombozyten durch eine isoliert perfundierte Verzweigung der A. carotis communis der Maus perfundiert, die im Anschluss mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert wurde. Zusätzlich zeigte sich in diesen Versuchen, dass in Gefäßen von ApoE-Knockout Mäusen nach sCD40L-Stimulation hoch signifikant zehnmal mehr Monozyten adhärieren als in nicht-stimulierten Gefäßen dieser Tiere. Gegenüber stimulierten Gefäßen von Wildtyp, CD40-Knockout und vWF-Knockout Mäusen war die Adhäsion der Monozyten um den Faktor vier gesteigert. Somit konnte sowohl in einem humanen wie murinen ex vivo-Perfusionsmodell die CD40-Abhängigkeit der ULVWF-Multimer-Freisetzung und Monozytenadhäsion im Bereich einer klassischen Atherosklerose-Prädilektionsstelle nachgewiesen werden. Dieses neuartige ex vivo-Perfusionsmodell der Gefäßverzweigung stellt somit eine interessante Methode zur Untersuchung des Adhäsionsverhalten von Monozyten dar und könnte helfen die komplexen pathophysiologischen Vorgänge in der Frühphase der Atherosklerose besser zu verstehen.

Translation of abstract (English)

The ever-increasing life expectancy in industrial nations leads to an increased occurrence of age-related diseases like ischemic heart disease. Atherosclerosis is the underlying cause where monocytes are recruited to plaque predilection sites, e.g. at vessel curvatures and bifurcations, leading to increased stenosis of the vessel lumen. CD40 receptor and CD40 ligand interactions play an important role in monocyte recruitment as well as in inflammation of the vessel wall. The aim of this project therefore is to investigate, if an increased endothelial CD40 expression at atherosclerosis predilection sites is responsible for the recruitment and activation of monocytes in the early phase of atherosclerosis. For this purpose, an inducible transgenic ApoE knockout mouse model with tamoxifen-induced endothelial cell-specific depletion of CD40 was generated. Using this model, it was planned to quantify plaque development and progression in the early phase of atherosclerosis by means of high-resolution ultrasound imaging and oil red O staining. Because it was not possible to verify the specific depletion of CD40 in the endothelial cells, a human in vitro vessel bifurcation model, the ibidi Y-Slide, was used to investigate the adhesion behaviour of fluorescent dye stained monocytes to endothelial cells via platelet-decorated ultra-large von Willebrand factor (ULVWF) multimers by means of fluorescence microscopy. Thereby, a significant increase of ULVWF multimer release and monocyte adhesion in the vicinity of the bifurcation was detected. These findings could be reproduced in a novel murine ex vivo perfusion model. Herein the isolated A. carotis communis with the following bifurcation into the A. carotis interna and A. carotis externa was perfused with isolated and fluorescent dye labelled murine monocytes and platelets, and subsequently analysed by way of fluorescence microscopy. In addition, a highly significant ten-fold increase in monocyte adhesion within vessels of ApoE knockout mice could be observed after stimulation with soluble CD40 ligand. In comparison to stimulated vessels of wild type, CD40 knockout and vWF knockout mice the increase in monocyte adhesion was fourfold. Thus, the CD40 dependency of ULVWF multimer release and monocyte adhesion at a classical atherosclerosis predilection site could be demonstrated in a human as well as in a murine perfusion model. This novel ex vivo bifurcation perfusion model represents an interesting method for investigating monocyte adhesion behaviour and could assist in improving the understanding of the complex pathophysiological processes in the early phase of atherosclerosis.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hecker, Prof. Dr. Markus
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 19 December 2018
Date Deposited: 09 Jan 2019 07:35
Date: 2019
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut fuer Physiologie und Pathophysiologie
Subjects: 570 Life sciences
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