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Light-energy conversion in rhodopsins studied by time-resolved serial femtosecond crystallography

Nass Kovacs, Gabriela

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Abstract

Light is an important environmental factor used by light-sensitive proteins, photoreceptors, as a source of information or energy. In several classes of photoreceptors, photon absorption triggers the isomerization around a double bond in the light-sensitive chromophore. In rhodopsins, the isomerization of the chromophore retinal is one of the fastest light-triggered processes and it initiates different, protein-specific functions, spanning from vision and sleep regulation to light-energy conversion and phototaxis. The best characterized rhodopsin is bacteriorhodopsin (bR), a light-activated proton pump. Spectroscopic techniques were used to characterize both the ultrafast processes related to the isomerization, but also the later steps when the translocation of protons occurs. Structural knowledge of the later intermediates was provided mostly by X ray crystal structures of cryo-trapped bR or its mutants, contributing to a good understanding of the proton pumping steps. However, the ultrafast processes evolving on a sub-ps and ps time-scale are not amenable for time-resolved X-ray crystallography using synchrotron radiation, thus no structures of the ultrafast bR intermediates could be obtained. This changed with the advent of novel X-ray sources, the X-ray free-electron lasers, which make time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) on the sub-ps time-scale possible. This enables to address the most puzzling questions about the isomerization not only spectroscopically and computationally, but also structurally. Why is the isomerization of retinal in rhodopsins highly bond-specific and efficient, whereas it is neither specific nor efficient when retinal is free in solution? Is the protein affecting the isomerization reaction not only sterically, but also actively? This work used TR-SFX to obtain structures of the ultrafast intermediates in bR in order to observe the structural changes in the retinal and in the protein on the sub-ps and ps time-scale. Large quantities of well-diffracting bR microcrystals were prepared in very viscous lipidic cubic phase. Time-resolved SFX experiments were performed only with liquid samples before the start of this thesis, therefore methods used for delivery of viscous samples in SFX needed to be adapted specifically for this time-resolved experiment. The crystal structures obtained in the TR-SFX experiment on bR visualize the torsion of the isomerizing double bond in retinal. They also show oscillatory motion in the retinal and in specific protein residues and their distances to other residues or to ordered, functionally relevant water molecules. Changes in the distances in the internal hydrogen-bonded network of water molecules and protein residues are also observed. Similar to many TR-SFX experiments, this experiment was performed at very high pump laser excitation intensity, which can induce multiphoton processes, complicating the functional interpretation of the observations made. Unlike other TR-SFX experiments, this work acknowledges and addresses this caveat. Since the TR-SFX experiment could not be repeated at lower laser excitation intensity, additional spectroscopic and computational studies were carried out instead to gain more insight into multiphoton processes. These indeed provide new findings about decay channels in the multiphoton regime. Yet, it still remains open what the implications for the observations made in the TR-SFX structures are. In spite of that, a comparison of the TR-SFX observations with published spectroscopic and computational work performed in the single-photon regime shows remarkable similarities. The insights obtained in this work pave the way for future TR-SFX experiments using optimal excitation conditions, which will clarify the relation of the observed structural changes to single-photon processes. This will allow judging whether the concerted motions observed in the retinal, residues and water molecules are part of the mechanism by which the protein actively controls the isomerization reaction of the chromophore. Furthermore, the methodological advances established here with the model system bR can now be directly applied to study other more challenging rhodopsins, such as the new family of anion-conducting channelrhodopsins (ACR). This work established insect-cell expression of an ACR protein and identified crystallization conditions yielding showers of microcrystals, which is the first step towards a future TR-SFX experiment.

Translation of abstract (German)

Licht ist ein wichtiger Umweltfaktor, der von lichtempfindlichen Proteinen, so genannten Fotorezeptoren, als Informations- oder Energiequelle genutzt wird. In mehreren Klassen von Fotorezeptorproteinen löst die Lichtabsorption die Isomerisierung um eine Doppelbindung im lichtempfindlichen Cofaktor aus. Im Rhodopsin startet die Isomerisierung des Retinal-Cofaktors, einer der schnellsten licht-induzierten Prozesse, verschiedene proteinspezifische Funktionen, vom Sehen und Regulation der circadianer Rhytmik bis zur Lichtenergieumwandlung und Phototaxis. Das am besten charakterisierte Rhodopsin ist Bacteriorhodopsin (bR), eine lichtaktivierte Protonenpumpe. Mit spektroskopischen Methoden wurden sowohl die mit der Isomerisierung verbundenen ultraschnellen Prozesse als auch die späteren Schritte wie die Translokation von Protonen charakterisiert. Strukturelles Wissen über die späteren Intermediate wurde hauptsächlich durch Röntgenkristallstrukturen von Tieftemperatur-stabilisiertem bR Wildtyp oder bR Mutanten bekommen, was zu einem guten Verständnis der Protonenpumpschritte beitrug. Die ultraschnellen Prozesse, die sich auf einer sub-ps- und ps-Zeitskala entwickeln, können jedoch nicht durch zeitaufgelöste Röntgenkristallographie unter Verwendung von Synchrotronstrahlung aufgelöst werden, so dass keine Strukturen der ultraschnellen bR-Intermediaten erhalten werden konnten. Dies änderte sich mit dem Aufkommen neuartiger Röntgenquellen, den Röntgen-Freie-Elektronenlaser (XFEL), die eine zeitaufgelöste Serielle femtosekunden-Kristallographie (TR-SFX) auf der sub-ps-Zeitskala ermöglichen. Dies erlaubt, die offene Frage zur Isomerisierung nicht nur spektroskopisch und quanten-mechanisch, sondern auch strukturell zu beantworten. Warum ist die Isomerisierung von Retinal in Rhodopsinen hoch bindungsspezifisch und effizient, während dies für freies Retinal in Lösung nicht der Fall ist? Beeinflusst das Protein die Isomerisierungsreaktion nicht nur sterisch, sondern auch aktiv? Diese Arbeit verwendete TR-SFX, um Raumstrukturen der ultraschnellen Intermediate in bR zu bestimmen und dadurch die strukturellen Änderungen im Retinal und im Protein auf der sub-ps- und ps-Zeitskala zu beobachten. Große Mengen gut beugender bR-Mikrokristalle wurden in einer sehr viskosen kubischen Lipid-phase hergestellt. Zeitaufgelöste SFX-Experimente wurden vor Beginn dieser Arbeit nur mit flüssigen Proben durchgeführt. Daher mussten die Methoden zur Injektion viskoser Proben in den XFEL-Strahl speziell für dieses zeitaufgelöste Experiment angepasst werden. Die im TR-SFX-Experiment an bR erhaltenen Kristallstrukturen machen die Torsion der isomerisierenden Doppelbindung im Retinal sichtbar. Sie zeigen auch eine oszillatorische Bewegung im Retinal und in bestimmten Proteinresten und deren Abstände zu anderen Resten oder zu geordneten funktionell relevanten Wassermolekülen. Veränderungen der Abstände im inneren wasserstoffgebundenen Netzwerk von Wassermolekülen und Proteinresten werden ebenfalls beobachtet. Ähnlich wie bei vielen anderen TR-SFX Experimenten wurde dieses Experiment bei einer sehr hohen Pumplaser-Anregungsintensität durchgeführt, die Multiphotonenprozesse induzieren kann, was die funktionelle Interpretation der gemachten Beobachtungen kompliziert. Im Gegensatz zu anderen TR-SFX-Experimenten wird diese Einschränkung in dieser Arbeit angesprochen. Da das TR-SFX-Experiment nicht bei niedriger Laseranregungsintensität wiederholt werden konnte, wurden stattdessen zusätzliche spektroskopische und quanten-mechanische Untersuchungen durchgeführt, um mehr Einblick in Multiphotonenprozesse zu erhalten. Diese liefern in der Tat neue Erkenntnisse über Zerfallskanäle im Multiphoton-System. Es bleibt jedoch noch offen, welche Auswirkungen dies auf die Beobachtungen in den TR-SFX-Strukturen hat. Trotzdem zeigt ein Vergleich der TR-SFX Beobachtungen mit veröffentlichten spektroskopischen und quanten-mechanischen Arbeiten, die im Einphotonenbereich durchgeführt wurden, bemerkenswerte Ähnlichkeiten. Die Erkenntnisse aus dieser Arbeit legen die Grundlagen für zukünftige TR-SFX Experimente mit optimalen Anregungsbedingungen, die den Zusammenhang zwischen den beobachteten strukturellen Veränderungen und Einphotonenprozessen erklären können. Das wird ermöglichen zu beurteilen, ob die koordinierte Bewegungen, die im Retinal, Proteinresten und Wassermolekülen beobachtet werden, Teil des Mechanismus sind, durch den das Protein die Isomerisierungsreaktion des Chromophors aktiv steuert. Darüber hinaus können die hier etablierten methodischen Fortschritte mit dem Modellsystem bR nun direkt zur Untersuchung anderer anspruchsvollerer Rhodopsine wie der neuen Familie von anionleitenden Channelrhodopsinen (ACR) angewendet werden. In dieser Arbeit wurde die Expression eines ACR-Proteins in Insektenzellen etabliert und Bedingungen für die Mikrokristallisation identifiziert. Dies ist der erste Schritt auf dem Weg zu einem zukünftigen TR-SFX-Experiment.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schlichting, Prof. Dr. Ilme
Date of thesis defense: 29 March 2019
Date Deposited: 23 May 2019 06:35
Date: 2019
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > Max-Planck-Institute allgemein > MPI for Medical Research
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
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