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HDAC10 in neuroblastoma chemoresistance

Ridinger, Johannes

German Title: (Die Rolle von) HDAC10 in der Chemoresistenz des Neuroblastoms

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Abstract

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in childhood, and characteristically displays a wide variety of clinical outcomes. While prognosis is generally favorable in low-risk and intermediate-risk tumors, outcome remains poor in high-risk neuroblastoma, and infaust in case of relapse. Multidrug resistance is frequent in high-risk neuroblastoma and remains to be one of the major factors limiting treatment success despite intensive multimodal therapy regimens, highlighting the need for novel treatment approaches capable of reducing neuroblastoma drug resistance. Histone deacetylases (HDACs) are involved in numerous cancer-relevant pathways and have become attractive anti-tumor targets due to their excellent druggability. Broadband inhibition of HDACs is, however, associated with dose-limiting side effects, which can be possibly circumvented by the inhibition of individual tumor-relevant isozymes. Previous work of our group has shown that high expression of class IIb histone deacetylase HDAC10 supports chemoresistance of neuroblastoma cells by promoting macroautophagy. Data suggested that HDAC10 was critical for lysosomal function, but the precise lysosomal role of HDAC10 and its cellular substrates remained unknown. The data presented in this study indicate that HDAC10 is crucial for lysosomal homeostasis in a number of highly drug-resistant neuroblastoma cell lines (SK-N-BE(2)-C, IMR-32, SK-N-AS) while being dispensable in others (Kelly, NB-1) and in non-transformed fibroblasts. In HDAC10-dependent cells, interference with HDAC10 function causes accumulation of lysosomes, a phenotype that is not observed in case of functional interference with the highly homologous class IIb member HDAC6. Depletion or inhibition of HDAC10 further interferes with downstream lysosomal processes such as lysosomal exocytosis, indicating that accumulating lysosomes are dysfunctional. Lysosomal accumulation and the inhibition of lysosomal exocytosis in turn promote intracellular accumulation of weakly basic chemotherapeutics such as doxorubicin, which does not remain sequestered in lysosomes but is also highly enriched in nuclei. Consequently, co-treatment with doxorubicin and HDAC10 inhibitors efficiently promotes cell death in treatment resistant neuroblastoma cell lines while sparing non-malignant cells. Lysosomal exocytosis is an important pro-survival mechanism under cytotoxic treatment. Inhibition of HDAC10, and thus lysosomal exocytosis, sensitizes cells not only by promoting doxorubicin accumulation, but also by inhibiting the process of lysosomal exocytosis itself. Moreover, interference with HDAC10 function promotes accumulation of DNA double-strand breaks (DSBs) both in absence and presence of doxorubicin, suggesting an additional role for HDAC10 in DSB repair. Preliminary data of mass spectrometric analyses of protein lysine acetylation after HDAC10 inhibition suggest that HDAC10 modulates acetylation of the V-ATPase subunit A and the Ku70/Ku80 complex member Ku80. It is thus conceivable that HDAC10 modulates lysosomal function at the level of lysosomal acidification, as well as DNA repair at the level of non-homologous end joining of DSBs. The recently published function of HDAC10 as N8-acetylspermidine deacetylase remains to be confirmed. Follow-up studies on the mechanistic role of HDAC10 could be greatly facilitated by a highly specific HDAC10 antibody. In this context, several promising HDAC10-reactive mouse hybridoma clones were generated, but recurring instability of the promising hybridoma clones delayed stable production of the antibody. In summary, in this thesis, a novel function of HDAC10 in regulation of lysosomal downstream mechanisms was identified and a previously published role of HDAC10 in DNA repair was confirmed. These mechanisms possess the translational potential to overcome drug resistance in combination with chemotherapies.

Translation of abstract (German)

Das Neuroblastom ist der häufigste solide extrakranielle Tumor im Kindesalter und zeichnet sich durch sein variables klinisches Erscheinungsbild aus. Während die Heilungschancen bei Patienten der niederen und mittleren Risikogruppen in der Regel günstig sind, weisen insbesondere sogenannte Hochrisiko-Neuroblastome und rezidivierende Tumore eine schlechte bzw. infauste Prognose auf. Hochrisiko-Neuroblastome sind dabei häufig durch eine gesteigerte Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Zytostatika gekennzeichnet, was trotz intensiver multimodaler Therapien zu einem Therapieversagen führt und die Notwendigkeit neuer resistenzbrechender Behandlungsansätze im Neuroblastom unterstreicht. Histondeacetylasen (HDACs) sind entscheidend an der Steuerung vieler krebsrelevanter Prozesse beteilig, was sie, zusammen mit ihrer exzellenten Wirkstoff-Bindungsfähigkeit, interessant für die Tumortherapie macht. Dabei geht die Breitbandinhibition der HDACs jedoch mit dosislimitierenden Nebenwirkungen einher, was mit der gezielten Hemmung der tumorrelevanten Enzyme umgangen werden könnte. Eine vorangegangene Studie unserer Arbeitsgruppe hat gezeigt, dass eine hohe Expression der Klasse IIb Histondeacetylase HDAC10 die Chemoresistenz von Neuroblastomzellen durch Antreiben der Makroautophagie fördert. Auch wenn die Daten dieser Studie darauf hindeuteten, dass HDAC10 bedeutend für die Lysosomenfunktion ist, blieben die genaue lysosomal Rolle der HDAC10 und deren nachgeschaltete zelluläre Substrate unbekannt. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten zeigen, dass HDAC10 in einigen der untersuchten Neuroblastommodelle (SK-N-BE(2)-C, IMR-32, SK-N-AS) eine entscheidende Rolle in der Homöostase sogenannter Lysosomen zukommt, während die Lysosomen anderer Neuroblastomzelllinien (Kelly, NB-1) und proliferierender Fibroblasten nicht durch HDAC10 beeinflusst sind. Bei einer Beeinträchtigung der HDAC10 Funktion kommt es in HDAC10-abhängigen Zellen zu einer Ansammlung von Lysosomen, was bei Hemmung der nahe verwandten HDAC6 nicht der Fall ist. Depletion und Inhibition von HDAC10 führen dabei weiterhin zu einer Störung nachgeschalteter lysosomaler Prozesse wie der lysosomalen Exozytose, was auf eine Dysfunktion der akkumulierenden Lysosomen hindeutet. In Folge der Ansammlung von Lysosomen und der Hemmung der lysosomalen Exozytose kommt es in den betreffenden Zelllinien zu einer Ansammlung schwach basischer Chemotherapeutika wie Doxorubicin, welche sich sowohl in Lysosomen und Zellkernen anreichern. Folglich führt die Kombinationsbehandlung mit Doxorubicin und HDAC10 Inhibitoren in Neuroblastomzellen, nicht aber in nicht-malignen Zellen, zu einer erhöhten Zelltodrate. Die lysosomale Exozytose selbst wird zu einem wichtigen Überlebensmechanismen unter Zytostatikabehandlung. Die Hemmung von HDAC10, und damit der lysosomalen Exozytose, sensitiviert Neuroblastomzellen dabei nicht nur durch vermehrte intrazelluläre Doxorubicinansammlung, sondern auch durch die Inhibition der lysosomalen Exozytose selbst. Des Weiteren erhöht die Hemmung der HDAC10 Funktion die Anzahl sogenannter DNA Doppelstrangbrüche sowohl in An- als auch in Abwesenheit von Doxorubicin, was auf eine Funktion von HDAC10 in der Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen hindeutet. Vorläufige massenspektrometrische Analysen der Lysin-Acetylierung in Proteinen nach HDAC10-Hemmung weisen darauf hin, dass HDAC10 die Acetylierung von Untereinheiten der V-ATPase bzw. des Ku70/Ku80-Komplexes beeinflusst. Es ist also denkbar, dass HDAC10 die Lysosomenfunktion auf Ebene der lysosomalen Ansäuerung, und DNA Reparatur auf Ebene der nicht-homologen Endverknüpfnung (non-homologous end joining) reguliert. Die kürzlich publizierte Funktion von HDAC10 als N8-Acetylspermidindeacetylase konnte in dem hier verwendeten Zellmodell noch nicht bestätigt werden. Zukünftige mechanistischen Studien würden durch einen hochspezifischen, bisher jedoch nicht verfügbaren, HDAC10 Antikörper vereinfacht. Im Rahmen dieses Projekts wurden mehrere vielversprechende HDAC10-reaktive Hybridomklone generiert, eine zuverlässige Produktion des HDAC10 Antikörpers verzögert sich jedoch bisher auf Grund wiederkehrender Instabilität dieser Hybridome. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eine neue Funktion von HDAC10 in der Regulation der Lysosomenfunktion gezeigt und eine bereits publizierte Rolle von HDAC10 in der DNA Reparatur bestätigt werden. Diese können als Angriffspunkte zur Minderung von Chemoresistenzen dienen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Mayer, Prof. Dr. Matthias
Date of thesis defense: 27 May 2019
Date Deposited: 26 Jun 2019 12:13
Date: 2019
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
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