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Oncolytic measles viruses to support BiTE and CAR T cell re-direction immunotherapies of solid tumors

Heidbüchel, Johannes Paul Walther

German Title: Onkolytische Masernviren zur Unterstützung von BiTE- und CAR-T-Zell-Immuntherapien solider Tumoren

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Abstract

Bispecific T cell engagers (BiTEs), artificial antibodies designed to cross-link T cells to tumor cells, and chimeric antigen receptors (CARs), expressed on the surface of modified T cells and transferring activating signals via intracellular domains, can re-direct T cells to tumor surface antigens for efficient treatment of hematological malignancies. In solid tumors, however, these novel immunotherapies face fundamental challenges: Physical exclusion of T cells and an immunosuppressive microenvironment prevent efficacy while systemic administration is associated with severe toxicities. Oncolytic viruses have emerged as ideal agents for combination immunotherapies, as lytic replication in tumors does not only induce tumor debulking, but also immunogenic cancer cell death and local inflammation. We therefore hypothesized that oncolytic virotherapy, by eliminating physical barriers and reversing local immunosuppression, can promote anti-tumor T cell responses and thus provide a potent treatment option for solid tumors in combination with T cell re-direction. We furthermore hypothesized that tumor-targeted expression of a virus-encoded BiTE could achieve local BiTE activity without systemic side effects. To test these hypotheses, we engineered oncolytic measles viruses (MV) encoding BiTEs targeting CD20 or carcinoembryonic antigen, respectively, as model antigens (MV-BiTE). Kinetics of viral replication and virus-mediated cytotoxicity showed minor differences compared to unmodified virus, and functional BiTEs could be obtained from the supernatant of virus-infected cells. A newly established syngeneic solid tumor model of B16-CD20-CD46 murine melanoma cells stably expressing human antigens CD20 and CD46 as BiTE target antigen and measles virus entry receptor, respectively, engrafted in immunocompetent C57BL/6 mice when implanted subcutaneously. In this model, treatment with MV-BiTE targeting CD20 significantly prolonged survival compared to control treatments with unmodified MV, MV encoding CEA-specific control BiTE, purified BiTE, or carrier fluid only, respectively. UV irradiation of MV-BiTE completely inhibited viral replication but did not abrogate efficacy in this model. Treatment efficacy was furthermore not impaired in mice previously immunized with MV. Increased T cell infiltration into tumors and an effector T cell phenotype characterized by high intratumoral CD8+ T cell levels and low relative abundance of regulatory T cells was observed upon MV-BiTE treatment. Targeted transcriptome analysis revealed upregulation of genes associated with T cell activation, proliferation, and differentiation, but also with inhibition and exhaustion, providing a rationale for combination with checkpoint inhibitors. Combinations of MV, BiTE, and CAR T cell therapies were investigated in a pancreatic cancer model. Cytotoxic potential of each treatment alone towards human pancreatic adenocarcinoma cells was observed in vitro. However, no significant benefit of combinations was observed in a pilot experiment in immunodeficient mice, and T cell persistence was limited. For future in vivo monitoring of T cells by magnetic resonance imaging, labeling with iron oxide nanoparticles was established. In addition, we describe a mathematical model for in silico predictions of treatment outcome to optimize scheduling of combination therapies. Taken together, this study shows for the first time efficacy of a BiTE-encoding oncolytic virus in an immunocompetent mouse model. This warrants further investigations towards future translation. We furthermore introduced a mathematical model of combination immunovirotherapy to further support the development of novel treatment options for cancer patients.

Translation of abstract (German)

Mithilfe von künstlichen bispezifischen Antikörpern (BiTEs) oder durch gentechnische Einführung chimärer Rezeptoren (CARs) lassen sich T-Zellen auf Tumor-Oberflächenantigene umlenken. Diese neuen Immuntherapien werden klinisch bereits zur Behandlung von hämatologischen Neoplasien eingesetzt. Der therapeutische Nutzen von BiTE- oder CAR-T-Zell-Therapien über diese Entitäten hinaus ist allerdings begrenzt, da die systemische Gabe mit schweren bis lebensbedrohlichen Nebenwirkungen verbunden sein kann und solide Tumoren über physikalische Barrieren und immunsuppressive Mechanismen verfügen, die das Eindringen sowie die anti-tumorale Aktivität von T-Zellen verhindern. Onkolytische Viren sind gekennzeichnet durch einen Tumorzell-spezifischen, lytischen Replikationszyklus, was einerseits zu einer direkten Reduktion der Tumorlast und andererseits zu einer lokalen Entzündungsreaktion führen kann, die eine anti-tumorale T-Zell-Antwort begünstigt. Daraus leiten wir die Hypothese ab, dass die Kombination von Virotherapie mit T-Zell-Umlenkung eine wirksame Behandlung von soliden Tumoren ermöglicht, was in dieser Arbeit experimentell untersucht wurde. Wir vermuteten weiterhin, dass die gezielte Expression von virus-kodierten BiTEs durch infizierte Tumorzellen eine starke, lokal begrenzte Umlenkung von T-Zellen bei geringerer Toxizität gegenüber systemischer Applikation bewirken kann. Um diese Hypothesen zu testen, entwickelten wir Masern-Impfstamm-Viren (MV), die in ihrem Genom BiTEs kodieren, die entweder CD20 oder CEA, zwei Modell-Tumorantigene, erkennen und T-Zellen darauf umlenken können (MV-BiTE). Diese Viruskonstrukte zeigten im Vergleich zu unmodifizierten Impfviren nur geringe Unterschiede im Hinblick auf Replikationsgeschwindigkeit und lytische Aktivität, und funktionelle BiTEs konnten aus dem Überstand virusinfizierter Zellen isoliert werden. Eine neue Tumorzelllinie auf Basis der Maus-Melanom-Zelllinie B16, die zusätzlich die humanen Antigene CD20 als BiTE-Zielantigen und CD46 als Masernvirus-Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimiert, formte subkutane Tumoren in syngenen immunkompetenten C57BL/6-Mäusen. In diesem Modell verlängerte die Tumorbehandlung mit CD20-spezifischen MV-BiTE das Überleben von Mäusen signifikant im Vergleich zu unmodifizierten MV, zu Kontrollviren, die den CEA-spezifischen BiTE kodieren, zu aufgereinigten BiTEs, und zur Injektion von Pufferlösung ohne Viren. Bestrahlung von MV-BiTE mit UV-Licht inhibierte effektiv die Replikationsfähigkeit der Viren, führte aber nicht zur Unwirksamkeit der Behandlung. Außerdem war die Behandlung auch in zuvor mit Masernviren immunisierten Tieren wirksam. Im Vergleich zu Kontrollbehandlungen wiesen die mit MV-BiTE behandelten Tumoren eine erhöhte Infiltration von T-Zellen sowie ein von zytotoxischen Effektorzellen geprägtes T-Zell-Profil mit wenigen regulatorischen T-Zellen auf. Die Transkriptomanalyse von Tumorproben zeigte eine verstärkte Expression von Genen, die mit der Aktivierung, Proliferation und Differenzierung, aber auch der Inhibition und Erschöpfung von T-Zellen assoziiert sind. Dies bietet eine Rationale für zukünftige Kombination von MV-BiTE mit Immuncheckpoint-Inhibitoren. Kombinationen von CAR-T-Zell-, BiTE- und MV-Therapien wurden in einem Pankreastumor- Modell untersucht. Alle untersuchten Kombinationen zeigten zytotoxisches Potential gegenüber menschlichen Pankreas-Adenokarzinom-Zellen in vitro. In einem Pilotexperiment in immundefizienten Mäusen wurde jedoch keine erhöhte Wirksamkeit der Therapiekombinationen nachgewiesen und die Persistenz von transferierten humanen T-Zellen war limitiert. Um zukünftig transferierte T-Zellen in Mäusen über einen längeren Zeitraum hinweg mittels nichtinvasiver Magnetresonanztomographie visualisieren zu können, wurde ein Protokoll zur T-Zell-Markierung mit Eisenoxid-Nanopartikeln etabliert. Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit ein mathematisches Modell zur Simulation kombinierter Viro- und T-Zell-Immuntherapien erstellt, um die Behandlungsplanung durch in silico-Experimente zu optimieren. Zusammengefasst liegt hiermit erstmals eine Studie vor, die die Wirksamkeit von BiTE-kodierenden onkolytischen Viren in einem immunkompetenten Modell nachweist. Diese Ergebnisse machen weitere translationale Forschung nötig, um das Konzept auf seine klinische Anwendbarkeit hin zu prüfen. Auch das entwickelte mathematische Modell kombinierter Immunovirotherapien kann zu einer Entwicklung neuer Behandlungsoptionen für Krebspatienten beitragen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bartenschlager, Prof. Dr. Ralf
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 27 May 2019
Date Deposited: 26 Jun 2019 12:06
Date: 2019
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: oncolytic virotherapy, cancer immunotherapy, bispecific T cell engager (BiTE), chimeric antigen receptor (CAR) T cells, measles virus, RNA virus vectors
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