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Genetically encoded FRET sensor to detect double-stranded RNA during viral infection

Bolbat, Andrey

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Abstract

Förster resonance energy transfer (FRET) is a quantum effect of energy transfer from the donor chromophore to the acceptor one via non-radiative dipole-dipole coupling when those chromophores are positioned close enough and in the right orientation to each other. Genetically encoded FRET sensors consist of donor and acceptor fluorescent protein pair (usually CFP/YFP) and a protein based sensing domain in between which responds to the presence or the activity of desired molecule via conformational change resulting in change of FRET efficiency. In this thesis, I developed a genetically encoded FRET sensor for detecting double stranded RNA (dsRNA) during viral infection. The response of eukaryotic cells to infection by RNA viruses is based to a large extent on the regulation by protein kinase R. Protein kinase R (PKR, RNA-regulated protein kinase, eIF2α kinase 2) becomes activated via homodimerisation in the presence of double-stranded RNA produced during replication of RNA viruses (or if endogenously present). Active PKR phosphorylates its target – mostly α subunit of eIF2 – and inhibits the translation of viral proteins. PKR is a two domain protein which consists of an N-terminal double-stranded RNA binding domain (RBD) and a C terminal catalytic domain separated by a 100-amino acid unstructured region. The idea exploited in the current project is based on the ability of the N-terminal PKR domain to undergo a conformational change when binding double-stranded RNA, hence functioning as a sensor for double-stranded RNA. The fluorescent sensor is completed by the addition of the fluorescent proteins mTurquoise and cp173Venus forming a FRET pair. I successfully tested the sensor termed KPR1 in vitro as well as in HeLa Kyoto cells against double-stranded RNA and found a high FRET increase upon binding. The sensor responded well to the presence of self-replicating subgenomic Hepatitis C Virus RNA replicon in Huh7 cells. The data on detection of full Hepatitis C infection was inconclusive.

Translation of abstract (German)

Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein quantenmechanischer Effekt des Energietransfers von einem Donor-Chromophor auf einen Akzeptor-Chromophor durch strahlungslose Dipol-Dipol Kopplung, wenn diese Chromophore nahe genug beieinander liegen und die richtige Orientierung haben. Genetisch kodierte FRET Sensoren bestehen aus einem Paar fluoreszierender Proteinen, dem Donor und Akzeptor (üblicherweise CFP/YFP) und einer dazwischenliegenden Protein-basierten Sensordomäne, die auf die Anwesenheit oder die Aktivität eines Moleküls durch Konformationsänderung reagiert, die in einer Änderung der FRET Effizienz resultiert. In dieser Dissertation entwickelte ich einen genetisch kodierten FRET Sensor für die Detektion doppelsträngiger RNA (dsRNA) während viraler Infektion. Die Antwort eukaryontischer Zellen auf die Infektion durch RNA-Viren basiert hauptsächlich auf der Regulation der Proteinkinase R. Proteinkinase R (PKR, RNA-regulierte Proteinkinase, eIF2α kinase 2) wird durch Homodimerisierung aktiviert in der Anwesenheit doppelsträngiger RNA, die während der Replikation von RNA-Viren erzeugt wird (oder falls endogen vorhanden). Die aktivierte PKR phosphoryliert das Zielprotein – meist handelt es sich dabei um die α-Untereinheit von eIF2 – und inhibiert the Translation viraler Proteine. PKR ist aus zwei Domänen aufgebaut, die aus einer N-terminalen doppelsträngigen RNA Bindedomäne (RBD) und einer C-terminalen katalytischen Domäne bestehen, getrennt durch eine unstrukturierte Region mit der Länge von 100 Aminosäuren. Das gegenwärtige Projekt basiert auf der Fähigkeit der N-terminalen PKR-Domäne, konformationelle Umlagerungen bei Bindung doppelsträngiger RNA zu untergehen und so als Sensor für doppelsträngige RNA zu fungieren. Der fluoreszierende Sensor wird vervollständigt durch die fluoreszierenden Proteine mTurquoise und cp173Venus, die ein FRET-Paar bilden. Erfolgreich testete ich den Sensor KPR1 in vitro und in HeLa Kyoto Zellen in Anwesenheit doppelsträngiger RNA und fand einen deutlichen FRET-Anstieg infolge der Bindung. Der Sensor zeigte eine gute Antwort auf die Anwesenheit des selbst-replizierenden subgenomischen Hepatitis C Virus RNA Replicons in Huh7 Zellen. Die Daten für die Detektion einer vollständigen Hepatitis C Infektion blieben jedoch uneindeutig.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schultz, Prof. Dr. Carsten
Place of Publication: Heidelberg, Germany
Date of thesis defense: 4 June 2019
Date Deposited: 03 Jul 2019 13:38
Date: 2019
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
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