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Early phlebovirus host cell interactions: The small GTPase Rab11 and the autophagic factor Atg7 promote Uukuniemi virus entry

Hoffmann, Anja

German Title: Frühe Phlebovirus-Wirtszell-Interaktionen: Die kleine GTPase Rab11 und das Autophagieprotein Atg7 fördern den Viruseintritt

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Abstract

Phleboviruses, in the Phenuiviridae family within the Bunyavirales order, are important pathogenic arthropod-borne viruses (arboviruses), causing severe diseases in humans and domestic animals. Outbreaks are no longer limited to tropical and developing countries. Global trade, deforestation and global warming are reasons for the expansion of arthropod vectors, and the viruses they carry. The mosquito-borne phlebovirus Rift Valley fever (RVFV) spread from sub-Saharan parts of Africa over the entire continent and to the Arabic peninsula during the last two decades. As it already happened for other arboviruses (e.g. dengue virus), RVFV is now at risk of introduction into Southern Europe. Phleboviruses represent a risk to public health and agricultural productivity and must be taken seriously as potential emerging and reemerging pathogens. For humans, neither specific antiviral treatments nor vaccines are currently approved. Ideally, treating phlebovirus infection in humans, would target early virus-host cell interactions, preventing the release of the virus genome into the cytosol. Yet, the details of the entry pathways exploited by phleboviruses are mostly elusive, awaiting to be uncovered. For my PhD project, I used Uukuniemi virus (UUKV). UUKV is a validated biosafety level (BSL)-2 model for phleboviruses of higher biosafety classification such as RVFV. Our lab previously reported that UUKV enters human host cells by receptor-mediated endocytosis, transits Rab5-positive early endosomes and penetrates the cytosol from late endosomal compartments with a pH value around 5.4. With the aim to identify additional host factors involved in UUKV entry, two genome-wide siRNA screens were performed. In those screens, VAMP3 was identified to facilitate late endosomal penetration of UUKV. The v-SNARE protein VAMP3 plays an important role in recycling endosome trafficking and the initiation of autophagy. In addition to VAMP3, several other autophagy-associated host factors were found as potential host factors in the siRNA screens for UUKV entry. The overall goal of my PhD project was to clarify the role of autophagy in phlebovirus entry and decipher the molecular mechanisms subverted by phleboviruses to penetrate human host cells. Therefore, I analyzed UUKV infection by flow cytometry and confocal microscopy approaches. Within my PhD project, I assessed numerous autophagy-associated proteins for their role in UUKV infection. I identified the autophagic factor Atg7 and the small GTPase Rab11a as important host factors for UUKV infection. Atg7 is known mainly for its function in autophagosome maturation. Rab11a regulates recycling endosome trafficking and is involved in the initiation of autophagy. Addressing single steps of the virus entry process, I found that Atg7 and Rab11 specifically promote UUKV intracellular trafficking, while no effects were observed on other steps during early virus host cell interactions, i.e. binding or replication. Interestingly however, my results also indicate that Atg7 and Rab11 participate in UUKV infection in an autophagy-independent manner. In conclusion, this thesis expands our knowledge about entry of UUKV particles into human cells with a role of two more host factors, Rab11a and Atg7. Both proteins facilitate the transport of endocytosed viral particles from the plasma membrane to acidic endosomal compartments. Reaching these compartments is a critical step for acid-activated fusion and the subsequent release of the viral genome into the cytosol. Additionally, this work provides an indication of autophagy-independent functions of Atg7 in endosomal trafficking. The importance of Rab11a and VAMP3 in UUKV infection points towards a potential involvement of recycling endosomes in UUKV intracellular trafficking. UUKV represents a tool of choice to better understand the role of recycling endosomes in late endosomal trafficking, a function that remains elusive and is potentially exploited by other related and unrelated viruses.

Translation of abstract (German)

Phleboviren aus der Phenuiviridae Familie in der Ordnung Bunyavirales sind wichtige durch Arthropoden übertragene Viren (Arboviren), die schwerwiegende Krankheiten in Menschen und Nutztieren verursachen. Krankheitsausbrüche sind nicht mehr auf tropische - und Entwicklungsländer begrenzt. Globaler Handel, Abforstung und Klimaerwärmung sind Gründe für die Ausbreitung von Arthropodenvektoren, und deren Viren. Das durch Zecken übertragene Phlebovirus Rift Valley fever virus (RVFV) breitete sich innerhalb der letzten zwei Jahrzehnte von Teilen Subsahara-Afrikas über den gesamten Kontinent und die Arabische Halbinsel aus. Es besteht nun das Risiko, dass RVFV, wie bereits andere Arboviren (beispielsweise Dengue virus), in Südeuropa heimisch wird. Phleboviren stellen eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit und die landwirtschaftliche Produktivität dar und sollten als potentielle neu- oder wiederaufkommende Pathogene ernst genommen werden. Momentan sind für Menschen weder spezifische antivirale Medikamente noch Impfstoffe zugelassen. Idealerweise würde die Behandlung von Phlebovirusinfektionen in Menschen das Freisetzen des viralen Genoms in das Zytosol verhindern. Bislang bleiben die Details über die Transportwege, die von Phleboviren genutzt werden, unbekannt und warten darauf entdeckt zu werden. Für mein Promotionsprojekt arbeitete ich mit Uukuniemi Virus (UUKV). UUKV ist ein in Laboren der biologischen Sicherheitsstufe 2 validiertes Modell für Phleboviren einer höheren Sicherheitsstufe, beispielsweise RVFV. Unsere Labor hat zuvor gezeigt, dass UUKV humane Zellen durch Rezeptoren-vermittelte Endozytose betritt, über Rab5-positive, frühe Endosomen in späte Endosomen gelangt, von wo aus es bei einem pH-Wert von etwa 5.4 in das Zytosol eintritt. Mit dem Ziel weitere Wirtsfaktoren zu identifizieren, die am Zelleintritt von UUKV beteiligt sind, wurden zwei genomabdeckende siRNA-Screens durchgeführt. In diesen Screens wurde VAMP3 identifiziert, welches den Eintritt von UUKV von späten Endosomen erleichtert. Das v-SNARE Protein VAMP3 ist wichtig für den Transport von Recycling-Endosomen und die Einleitung von Autophagie. Neben VAMP3 wurden im siRNA-Screen weitere Autophagie-assoziierte Wirtsfaktoren als potentielle Wirtsfaktoren für den Zelleintritt von UUKV gefunden. Das übergreifende Ziel meines Promotionsprojekts war es, die Rolle von Autophagie im Phleboviruszelleintritt aufzuklären und molekulare Mechanismen, die von Phleboviren zum Eintritt in humane Zellen genutzt werden, zu entschlüsseln. Dazu habe ich UUKV-Infektion mit Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie analysiert. Während meines Promotionsprojekts habe ich die Rolle zahlreicher Autophagie-assoziierter Proteine in Bezug auf UUKV-Infektion untersucht. Ich habe den Autophagiefaktor Atg7 und die kleine GTPase Rab11 als wichtige Wirtsfaktoren identifiziert. Atg7 ist hauptsächlich bekannt für seine Funktion zur Reifung von Autophagosomen. Rab11a reguliert den Transport von Recycling-Endosomen und ist an der Initiation der Autophagie involviert. Durch das Analysieren einzelner Schritte des Viruszeintritts habe ich herausgefunden, dass Atg7 und Rab11 den intrazellulären Transport von UUKV-Partikeln begünstigen, während kein Effekt auf weitere Schritte während früher Viruswirtsinteraktionen festgestellt wurden, zum Beispiel Bindung und Replikation. Interessanterweise jedoch, deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass Atg7 und Rab11 in einer Autophagie-unabhängigen Funktion an der UUKV-Infektion teilhaben. Zusammenfassend erweitert diese Dissertation unser Wissen über den Zelleintritt von UUKV-Partikeln in humane Zellen um eine Rolle der beiden Wirtsfaktoren Rab11a und Atg7. Beide Proteine begünstigen den Transport endozytierter Viruspartikel von der Plasmamembran zu angesäuerten Endosomen. Das Erreichen von diesen Kompartimenten ist entscheidend für die durch niedrigen pH Wert aktivierte Membranfusion und die darauf folgende Freisetzung des viralen Genoms ins Zytosol. Zusätzlich weißt diese Arbeit auf eine Autophagie-unabhängige Funktion von Atg7 im Endosomentransport hin. Die Relevanz von Rab11a und VAMP3 für UUKV-Infektion weist auf eine Beteiligung von Recycling-Endosomen am Transport von UUKV-Partikeln hin. UUKV stellt ein Werkzeug zum besseren Verständnis der Rolle von Recycling-Endosomen für den Transport von späten Endosomen dar, eine bislang unbekannte Funktion, die möglicherweise von anderen verwandten und nicht verwandten Viren genutzt wird.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bartenschlager, Prof. Dr. Ralf
Date of thesis defense: 14 May 2019
Date Deposited: 09 Jul 2019 14:28
Date: 2020
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: RNS-Viren, Rab-Proteine, Autophagie <Physiologie>
Uncontrolled Keywords: Uukuniemi-Virus Rab11 Atg7
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