German Title: Molekulare und funktionelle Charakterisierung der Expression von P2Y12 in Tumor-assoziierten Makrophagen

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Abstract

Macrophages are phagocytic cells of the innate immune system that exert important functions for immunological and homeostatic processes. They have a high plasticity and can quickly adapt to different environments. While Th1 cytokines induce a pro-inflammatory macrophage phenotype (M1), Th2 cytokines promote an anti-inflammatory one (M2). At tumor initiation a M1 phenotype is predominant, which then switches to a M2-like phenotype during tumor progression. These tumor-associated macrophages (TAM) promote tumor growth and metastasis by the secretion of growth factors, matrix metalloproteinases and immunosuppressive mediators such as arginase-1, IL 10 and TGF-ß. In many tumor entities including melanoma a high TAM infiltration correlates with a poor patient outcome. Thus, macrophages provide a promising therapeutic target for adjuvant tumor therapies. In the past our group identified several novel markers for TAM such as STABILIN-1 and LYVE-1. These markers can be induced in vitro by the treatment of peripheral blood monocytes (pBM) with M-CSF/dexamethasone/IL-4 (MDI). Microarray analysis of these in vitro generated M2-like macrophages identified the purinergic, G protein coupled receptor P2Y12 as the highest up-regulated gene. So far, P2Y12 has been known to be expressed on microglia and platelets and is targeted therapeutically with clopidogrel, ticagrelor and prasugrel to treat thrombotic disorders. Since the expression of P2Y12 in TAM has not been described yet, the aim of this study was to characterize P2Y12 expression and its function in M2-like macrophages in vitro as well as in TAM in vivo. Since all commercially available antibodies failed to detect P2Y12 in transgenic P2Y12+ U937 cells, we generated a peptide antibody against human P2Y12 and confirmed the expression of P2Y12 receptor in MDI-treated pBM as well as in CD68+ and CD63+ TAM of melanoma in situ. Like in the human system, P2y12 can also be induced by the treatment of murine bone marrow-derived macrophages (BMDM) with MDI. We detected P2y12 expression in CD11b+ cells isolated from spleen, peritoneal fluid and subcutaneously transplanted B16F10 tumors of tumor-bearing mice. P2Y12 expression in murine TAM was confirmed by immunohistochemical staining of B16F10 tumors. Treatment of murine and human transgenic P2Y12+ macrophage-like cell lines with the P2Y12 receptor agonist ADP increased the expression of several cytokines and chemokines (in the murine system CXCL2 and TNF-α and in the human system CXCL2, CXCL7 and IL-8), indicating an immunomodulatory role for the receptor. Analyzing signaling pathways underlying the induction of these cytokines, we detected ERK as well as Akt phosphorylation in ADP-treated P2Y12+ U937 cells. Inhibition of these signaling pathways significantly impaired CXCL2, CXCL7 and IL-8 secretion. Since ADP acts as a chemoattractant for microglia cells, the migratory potential of P2Y12+ macrophages was evaluated. We could show that ADP promotes the migration of human pBM(MDI) as well as murine P2Y12+ Raw 264.7 cells in a transwell chamber. Pre-treatment with the P2Y12 antagonist PSB0739 abrogated the ADP-induced chemotaxis of P2Y12+ cells. Since it is known that dying cells release nucleotides that act as find-me signals for phagocytic cells, we set up a co-culture experiment with P2Y12+ Raw 264.7 cells and B16F1 melanoma cells, which we pre-treated with puromycin to induce cell death. Dying tumor cells promoted the migration of P2Y12+ macrophages. Administration of the ATP/ADP cleaving enzyme apyrase to the dying tumor cells or treatment of P2Y12+ Raw 264.7 cells with PSB0739 abrogated the cell-death induced migration of P2Y12+ macrophages. Taken together, our results indicate that P2Y12 is an important immunomodulatory macrophage receptor, which triggers migration of these cells towards ADP-rich tumor areas and is able to modulate the inflammatory environment upon ADP activation.

Translation of abstract (German)

Makrophagen sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die wichtige Funktionen für immunologische und homöostatische Prozesse ausüben. Die Phagozyten sind plastisch und können sich schnell an unterschiedliche Umgebungen anpassen. Während Th1 Zytokine einen pro-inflammatorischen Phänotyp induzieren (M1 Makrophagen), fördern Th2 Zytokine einen anti-inflammatorischen Phänotyp (M2 Makrophagen). Zu Beginn der Tumorentstehung dominiert ein M1 Phänotyp, welcher sich während des Tumorwachstums hin zu einem M2 Phänotyp entwickelt. Diese Tumor-assoziierten Makrophagen (TAM) fördern das Tumorwachstum und die Metastasierung indem sie Wachstumsfaktoren, Matrix-Metalloproteinasen und immunsuppressive Mediatoren wie beispielsweise Arginase-1, Interleukin-10 und TGF-ß sezernieren. In vielen Tumorentitäten, einschließlich dem Melanom, korreliert eine hohe TAM Infiltration mit einem schlechten Patienten Outcome. Daher eignen sich Makrophagen als vielversprechendes therapeutisches Target für adjuvante Tumortherapien. In der Vergangenheit identifizierte unsere Gruppe mehrere neue TAM Marker wie z. B. STABILIN-1 und LYVE-1. Diese Marker können durch Stimulation von humanen peripheren Blutmonozyten (pBMZ) mit M-CSF/Dexamethason/IL-4 (MDI) induziert werden. Eine Genexpressions-Analyse dieser in vitro generierten M2-ähnlichen Makrophagen identifizierte den purinergen, G-Protein gekoppelten Rezeptor P2Y12 als das stärkste hochregulierte Gen. Bislang ist bekannt, dass P2Y12 von Mikrogliazellen und Thrombozyten exprimiert wird und das therapeutische Target für Medikamente wie Clopidogrel, Prasugrel und Ticagrelor ist, die zur Behandlung thrombotischer Erkrankungen verschrieben werden. Da die Expression von P2Y12 in TAM bislang nicht beschrieben wurde, ist das Ziel dieser Studie die Expression des Rezeptors sowie seine Funktion in M2-ähnlichen Makrophagen in vitro sowie in TAM in vivo umfassend zu charakterisieren. Da kein kommerziell erhältlicher Antikörper P2Y12 in transgenen P2Y12+ U937 Zellen spezifisch nachweisen konnte, stellten wir einen Peptid-Antikörper gegen humanes P2Y12 her und bestätigten die Expression des Rezeptors in MDI-behandelten pBMZ sowie in CD68+ und CD163+ TAM des Melanoms in situ. Ähnlich wie im Menschen kann P2y12 auch in der Maus durch die Stimulation von Knochenmarksmakrophagen mit MDI induziert werden. Wir detektierten P2y12 auch in CD11b+ myeloiden Zellen, welche aus der Milz, der Peritonealflüssigkeit sowie aus subkutan transplantierten B16F10 Tumoren von Tumor-tragenden Mäusen gewonnen wurden. Die P2Y12 Expression in murinen TAM wurde mit Hilfe von immunhistochemischen Färbungen von B16F10 Melanomen bestätigt. Eine Behandlung von murinen und humanen transgenen P2Y12+ Zelllinien mit dem Rezeptor-Agonist ADP erhöhte die Expression einiger Zytokine und Chemokine (in der Maus CXCL2 und TNF-α und im Mensch CXCL2, CXCL7 und IL-8), was auf eine immunmodulatorische Rolle des Rezeptors hindeutet. Wir analysierten Signalwege, die dieser Zytokininduktion zugrunde liegen könnten und fanden eine verstärkte ERK und Akt Phosphorylierung in ADP-behandelten P2Y12+ U937 Zellen. Eine Inhibierung dieser Signalwege verminderte die ADP-induzierte Sekretion von CXCL2, CXCL7 sowie IL-8. Da ADP als chemotaktisch wirksamer Botenstoff für Mikrogliazellen bekannt ist, untersuchten wir das migratorische Potential von P2Y12+ Makrophagen. Wir konnten zeigen, dass ADP sowohl die Migration von humanen MDI-stimulierten pBMZ als auch von P2Y12+ Raw 264.7 Zellen in einer Transwell-Kammer fördert. Eine Vorbehandlung mit dem P2Y12 Antagonist PSB0739 wirkte hemmend auf die ADP-induzierte Chemotaxis der P2Y12+ Zellen. Da bekannt ist, dass sterbende Zellen Nukleotide freisetzen, die als Aufspühr-Signale für Phagozyten fungieren, etablierten wir ein Co-Kultur Experiment mit P2Y12+ Raw 264.7 Zellen und B16F1 Melanomzellen, welche wir mit Puromycin behandelten, um den Zelltod dieser Zellen zu induzieren. Die sterbenden Tumorzellen verstärkten die Migration der P2Y12+ Makrophagen. Zugabe des ATP/ADP hydrolysierenden Enzyms Apyrase zu den sterbenden Tumorzellen oder Behandlung der P2Y12+ Raw 264.7 Zellen mit PSB0739 verhinderten die Zelltod-induzierte Migration der P2Y12+ Makrophagen. Zusammengefasst deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass P2Y12 ein wichtiger immunmodulatorischer Rezeptor ist, welcher die Migration von Makrophagen in Richtung ADP-reicher Tumorbereiche fördern und nach Aktivierung durch ADP die inflammatorische Umgebung modulieren kann.