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Analysis of protein-sphingolipid interactions in Influenza A-infected cells

Förster, Laura-Christin

German Title: Analyse der Interaktion von Proteinen und Sphingolipiden in Influenza A-infizierten Zellen

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Abstract

Influenza A virus (IAV) is a human respiratory pathogen causing seasonal en-demic and irregular pandemic flu infections. The ability to undergo rapid anti-genic changes is a reason for the persistent clinical relevance of IAV as contin-uously novel subtypes emerge, severely compromising vaccine effectiveness. IAV budding is initiated by the viral glycoproteins hemagglutinin (HA) and neu-raminidase (NA) and occurs at apical plasma membrane regions, referred to as microdomains or membrane rafts, which are enriched in cholesterol and (gly-co)sphingolipids. Sphingolipids (SLs) derive from the amino alcohol sphingo-sine and represent major building blocks of cellular membranes and important cell signaling molecules. SLs seem to play a crucial role in viral assembly as a defect in sphingomyelin (SM) biosynthesis has been shown to compromise cell surface transport of HA and NA, as well as budding and release of progeny viri-ons. In addition, SLs are significantly enriched in the viral envelope. However, direct evidence for an IAV-triggered modulation of SL metabolism and the con-tribution of specific SL classes, species, metabolites or SL metabolising en-zymes to viral propagation is still lacking. The aim of this thesis was to shed light on the role of SLs and SL-binding host proteins in the IAV replication cycle. Photoactivatable and clickable sphingosine (pacSph) was employed to monitor protein-SL interactions in sphingosine-1-phosphate lyase (S1PL)-deficient cells. Here, the goal was i) to analyse the SL-binding potential of viral proteins, especially HA and NA, of different IAV sub-types, ii) to perform a proteome-wide mapping of protein-sphingolipid interac-tions at early and late stages of infection, and iii) to study roles of long-chain SL species for IAV propagation using CRISPR/Cas9-mediated ceramide synthase 2 (CerS2) knock-out (KO) cells. Transfection and infection experiments suggest that HA and NA homologues display different SL-binding efficiencies. Employing a SILAC-based proteomic approach, a set of proteins was identified showing altered SL-interaction dy-namics in infected cells. Here, integrin beta-1 (ITGB1) was further investigated as a potential pro-viral SL-binding host target. Knock-out cell models showed that loss of CerS2 resulted in increased infection efficiency in HeLa cells. Nota-bly, the KO of CerS2 correlated with an elevation of dihydro-SL (DHSL) levels. DHSLs have been reported to increase upon IAV and other viral infections, and might thus also be responsible for the observed pro-viral effect. How the ab-sence of CerS2 affects cellular DHSL levels and how this alters host cell infec-tivity remains to be studied in future experiments. Together these data provide novel insights into the role of sphingolipids in the IAV replication cycle and might eventually paving the path for new therapeutic targets in the combat against IAV.

Translation of abstract (German)

Das Influenza A Virus (IAV) ist ein respiratorischer Krankheitserreger, welcher saisonal endemische und spontan auftretende pandemische Grippeinfektionen beim Menschen hervorruft. Durch die kontinuierlichen Veränderungen der anti-genen Eigenschaften des Virus entstehen fortlaufend neue IAV Subtypen, wel-che sich drastisch auf die Effektivität von Grippeimpfstoffen auswirken können und zu der persistierenden klinischen Relevanz von IAV beitragen. Der Zusammenbau des Viruspartikels wird durch die viralen Glykoproteine Hä-magglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) initiiert. Die virale Morphogenese findet in spezifischen, apikalen Plasmamembranregionen der Wirtszelle statt, welche auch Mikrodomänen oder „Lipid Rafts“ (Lipidflöße) genannt werden. Diese sind durch eine Anreicherung an Cholesterol und (Glyko-)Sphingolipiden charakterisiert. Sphingolipide (SL) sind Derivate des Aminoalkohols Sphingosin und Hauptbestandteile zellulärer Membranen sowie bedeutende Signaltrans-duktionsmoleküle. SL scheinen zudem eine essentielle Rolle in der Morphoge-nese viraler IAV Partikel zu besitzen, da Defekte im Biosyntheseweg von Sphingomyelin (SM) den Transport von HA und NA zur Zelloberfläche sowie den Aufbau und die Freisetzung von Nachfolgeviren beeinträchtigen. Zudem weist die Virushülle eine Anreicherung an SL auf. Ob das IAV einen direkten Einfluss auf den Stoffwechsel von SL besitzt und welche Klassen, Spezies, Me-taboliten oder SL-metabolisierende Enzyme für die virale Replikation von Signi-fikanz sind ist jedoch weitgehend unbekannt. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Rolle von SL und SL-bindenden Wirtsproteinen, die für den Replikationszyklus des IAV eine Rolle spielen könn-ten, näher zu untersuchen. Hierfür wurde photoaktivierbares und klickbares („clickable“) Sphingosin (pacSph) verwendet, um Protein-SL Interaktionen in Sphingosine-1-phosphat-Lyase (S1PL)-defizienten Zellen zu detektieren. So sollte (i) das SL-bindende Potential viraler Proteine, speziell von HA und NA, verschiedener IAV Subtypen analysiert werden, (ii) durch Proteomanalyse Pro-tein-SL Interaktionen von Wirtszellproteinen mit SL in verschiedenen Infektions-stadien untersucht werden und (iii) die Rolle von langkettigen SL Spezies in der IAV Replikation mit Hilfe eines CRISPR/Cas9-basierten Knock-outs der Cera-mid-Synthase 2 (CerS2) erforscht werden. Transfektions- und Infektionsexperimente ergaben, dass homologe Proteine von HA und NA unterschiedliche SL-bindende Potentiale besitzen könnten. Des Weiteren konnten durch eine SILAC-basierte Proteomuntersuchung verschie-dene Proteine identifiziert werden, die eine unterschiedliche SL-Interaktionsdynamik in infizierten Zellen aufweisen. In diesem Rahmen wurde der Zusammenhang des SL-Interaktionspotentials von Integrin-beta 1 (ITGB1) und dessen proviralen Effektes näher untersucht. Zudem führte der Verlust von CerS2 zu einer verminderten Infektionseffizienz in HeLa Zellen. Der Knock-out hat jedoch auch zu einer Erhöhung von Dihydro-SL (DHSL) geführt. In anderen Studien wurde gezeigt, dass die Menge an DHSL in IAV und anderen viralen Infektionen ansteigt und dies die Ursache für den beobachtete proviralen Effekt in CerS2-defizienten HeLa Zellen sein könnte. Inwiefern die Abwesenheit von CerS2 zelluläre DHSL Level beeinflusst, und damit verbunden die Suszeptibili-tät gegenüber IAV erhöht, muss daher weiterhin experimentell untersucht wer-den.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Brügger, Prof. Dr. Britta
Place of Publication: Heidelberg, Deutschland
Date of thesis defense: 5 April 2019
Date Deposited: 13 Aug 2019 08:16
Date: 2019
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
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