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Abstract

Beyond its fundamental role in fulfilling the nutritional and energetic needs of the cell, metabolism has emerged as an important component of cellular regulatory processes which are central to diverse biological phenomena, ranging from cell differentiation to cancer and longevity. These metabolic pleiotropic roles often converge on the crosstalk with gene expression regulation which is sensitive to the availability of specific metabolites utilized for chromatin and RNA chemical modifications. These required metabolites are often assumed to freely diffuse into the nuclear space, with their key biosynthetic pathways mainly assigned to function elsewhere. However, considering that the intracellular environment is a rather viscous space where the free diffusion between the different compartments could be restricted, a significant question arises of how the nucleus ensures a reliable supply of these essential metabolites, especially as it is often a reaction-diffusion scenario and not only diffusion. Along these lines, the aim of the current PhD thesis was to explore the hypothesis that the nucleus could harbor extended metabolic networks, and not only individual enzymatic steps, for local production of nuclear-relevant metabolites. To examine this, firstly, nuclear proteomics data and nuclear localization signal motif analysis were utilized to assess the potentiality of a nuclear presence of the corresponding metabolic enzymes. Next, by employing stable isotope [U-13C]-based metabolomics analysis in isolated nuclei, we tracked an operational activity. Proximity ligation mass spectrometry for selected enzymatic players allowed us to examine their proximity interactome further corroborating a nuclear subcellular topology. Cumulatively, our data provided multi-level evidence for a functional metabolic pathway operating in a mammalian nucleus. The identified pathway is made of parts of the TCA cycle with intermediates having key roles in chromatin and RNA modifications, reflecting thus the presence of a metabolic nuclear niche ensuring a stable supply of essential metabolites with nucleus-relevant functionalities. The aforementioned crosstalk between metabolism and gene expression regulation highlights the importance of considering metabolic deregulations in pathophysiological conditions. Cancer metabolic alterations are a well-studied phenomenon. Yet, little is known for the metabolic physiology of residual cancer cells that survive treatment and contribute to cancer relapse. The current PhD thesis contributed to the characterization of the metabolic particularities of residual cancer cells derived from a mouse model of breast cancer. The analysis indicated that the residual cells, although phenotypically similar to their normal counterparts and despite the absence of oncogenes expression, preserved a tumorous metabolic memory with main characteristics of an enhanced glycolysis, deregulated TCA and urea cycle. Considering glycolysis’ central role, we next aimed at investigating the network-wide metabolic responses upon inhibition of two important facilitators of the pathway, namely lactate dehydrogenase A and the monocarboxylate transporters 1 and 2, involved in lactate generation and transportation, respectively, in cancer cell lines. The results revealed opposite changes in metabolite concentration pools in glycolysis and TCA cycle intermediates between the two inhibitors treatment, and an overall lower biosynthetic flux. Interesting metabolic nodes were identified that could potentially be therapeutically exploited. Uncovering and understanding metabolic network activities in previously overlooked places, like the existence of a nuclear multistep metabolic network, or the perseverance in cancer regressed cells of a metabolic phenotype mnemonic to the tumorous state, can shed light on the hitherto unknown mechanisms of gene regulation and its interplay with the metabolic state of a cell.

Translation of abstract (German)

Neben seiner grundlegenden Rolle in der Versorgung der Zelle mit Nährstoffen und Energie, hat der Stoffwechsel sich als wichtiger Bestandteil regulatorischer Prozesse herausgestellt, welche eine zentrale Rolle in biologischen Vorgängen einnehmen, die von der Zelldifferenzierung bis hin zu Krebs und Langlebigkeit reichen. Diese metabolischen pleiotropen Rollen laufen oft beim Crosstalk mit der Genexpressionsregulierung zusammen, die auf die Verfügbarkeit metabolischer Intermediate reagiert, welche für die chemische Modifikation von Chromatin und RNA vonnöten sind. Obwohl bestimmte metabolische Enzyme im Zellkern gefunden wurden, die an der Biosynthese der benötigten Metaboliten beteiligt sind, werden die Hauptstoffwechselwege nach wie vor anderen Bereichen der Zelle zugeschrieben. Es wird daher angenommen, dass die erforderlichen Metaboliten frei in den Kern diffundieren. Diese Annahme führt jedoch zu erheblichen Einschränkungen bei der Effizienz der Modifikationen, da die erhöhte Viskosität der intrazellulären Umgebung die Diffusion sogar kleiner Moleküle einschränken könnte, benötigte Metaboliten von anderen Enzymen abgefangen werden könnten und besonders da chemische Modifikationen oft Reaktions-Diffusionsprozesse sind. In diesem Zusammenhang war es das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit, die Hypothese zu untersuchen, dass der Zellkern ausgedehnte metabolische Netzwerke und nicht nur einzelne enzymatische Schritte für die lokale Produktion von kernrelevanten Metaboliten enthalten kann. Um dies zu untersuchen, wurden zunächst Zellkern-Proteomics-Daten und Kernlokalisierungssignalanalysen verwendet, um das Potenzial einer entsprechenden Präsenz von Stoffwechselenzymen im Kern zu bestimmen. Durch den Einsatz von stabilen Isotopen [U-13C]-basierten Fluxanalysen in isolierten Zellkernen wurde die operative Aktivität verfolgt. Durch die Proximity-Ligations-Massenspektrometrie für ausgewählte enzymatische Akteure im Stoffwechsel konnten wir ihr Proximity-Interaktom untersuchen, was eine subzelluläre Zellkerntopologie weiter untermauert. Zusammengefasst liefern unsere Daten einen mehrstufigen Nachweis für einen funktionellen Stoffwechselweg in einem Säugetierzellkern. Der identifizierte Weg besteht aus Teilen des TCA-Zyklus mit Intermediaten, die eine Schlüsselrolle bei Chromatin- und RNA-Modifikationen spielen. Dies spiegelt das Vorhandensein einer metabolischen Zellkernnische wider, die eine stabile Versorgung mit essentiellen Metaboliten mit kernrelevanten Funktionalitäten gewährleistet. Der zuvor erwähnte Crosstalk zwischen Metabolismus und Genexpressionsregulation unterstreicht die Bedeutung der Berücksichtigung von Stoffwechsel-Deregulierungen bei pathophysiologischen Zuständen. Krebstypische Stoffwechselveränderungen sind ein gut untersuchtes Phänomen. Über die Stoffwechselphysiologie von Krebszellen, die sich zurückentwickeln, die Behandlung überleben und zu Rückfällen beitragen ist jedoch wenig bekannt. Die vorliegende Doktorarbeit trug zur Charakterisierung der metabolischen Besonderheiten solcher residualen Krebszellen in einem Mausmodell für Brustkrebs bei. Die Analyse zeigte, dass die residualen Krebszellen trotz der phänotypischen Ähnlichkeit zu normalen Zellen und der Abwesenheit der Expression von Onkogenen ein tumoröses metabolisches Gedächtnis mit erhöhter Glykolyse und dereguliertem Harnstoff- und TCA-Zyklus bewahrten. In Anbetracht der zentralen Rolle der Glykolyse untersuchten wir in Krebszellen die netzwerkweiten metabolischen Auswirkungen der Inhibierung zweier zentraler Vermittler in der Glykolyse. Dabei handelte es sich um die Lactatdehydrogenase A und die Monocarboxylat-Transporter 1 und 2, die an der Bildung beziehungsweise dem Transport von Lactat beteiligt sind. Die Ergebnisse zeigten entgegengesetzte Änderungen in den Konzentrationen von Glykolyse und TCA-Zyklus-Intermediaten nach der Inhibitorbehandlung und einen allgemein verringerten Biosynthesefluss. In diesem Zusammenhang wurden interessante Metaboliten identifiziert, die therapeutisches Potential haben könnten. Zusammengenommen haben die Entdeckung und das Verständnis von Stoffwechselaktivitäten in versteckten und bisher übersehenen Bereichen, wie die Existenz einer mehrstufigen Stoffwechselarchitektur im Zellkern oder das Fortbestehen des an Krebszellen erinnernde Stoffwechselzustand in eigentlich zurückentwickelnden Krebszellen, weitreichende Implikationen für die bisher unbekannten Mechanismen der Genregulation und ihr Zusammenspiel mit dem Stoffwechselzustand der Zelle.