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Abstract

Whole transcriptome analysis of the human genome has revealed that the majority of the genome gives rise to non-protein-encoding or simply non-coding RNAs (ncRNAs). Long non-coding RNAs (lncRNAs) ranging from 200 nt to >100 kb represent a large subgroup of ncRNAs. They have emerged as critical players for not only regulating various physiological and developmental processes but also various cancers including liver cancer. Global cancer statistics report of 2018 has shown liver cancer to be the fourth leading cause of cancer-related deaths worldwide and has predicted it to be the sixth most commonly diagnosed cancer. Notably, advanced stage liver cancer has a poor overall survival rate of less than 20 % - thus warranting further investigations into the understanding of molecular mechanisms driving hepatocarcinogenesis, contributing to the discovery of improved diagnostic, prognostic and treatment modalities. Here, I performed a transcriptome-wide profiling of lncRNAs in liver cancer and identified a novel lncRNA, which I named lincNMR (long intergenic non-coding RNA - Nucleotide Metabolism Regulator). LincNMR was induced six-fold in hepatocellular carcinoma compared to normal liver tissue. Depletion of lincNMR in multiple liver cancer cell lines invoked a strong proliferation defect and lead to an induction of senescence. This phenotype was also observed in multiple breast and lung cancer cell lines suggesting cancer-wide role of lincNMR. Silencing of lincNMR caused a strong depletion of the key dNTP synthesizing enzymes RRM2, TK1 and TYMS implicating lincNMR in regulation of nucleotide metabolism. Notably, dNTP levels were significantly decreased in liver cancer cells upon the loss of lincNMR. Importantly, the proliferation defect induced by downregulation of lincNMR could be rescued by bathing the cells in exogenous pools of extracellular dNTPs. An in vivo RNA Antisense Purification combined with mass spectrometry (RAP-MS) approach identified YBX1 as a direct interaction partner of lincNMR. Furthermore, I show YBX1 as a regulator of RRM2, TK1 and TYMS gene expression and found lincNMR to control the transactivational activity of YBX1 as measured in luciferase assays. Lastly, I established the relevance of lincNMR for tumor growth in vivo using the Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) model. LincNMR-depleted tumors were significantly smaller in size and weight. In summary, I discovered a novel lncRNA, lincNMR, which regulates tumor cell proliferation through a YBX1-RRM2-TK1-TYMS axis governing nucleotide metabolism.

Translation of abstract (German)

Die vollständige Transkriptomanalyse des menschlichen Genoms erwies, dass ein Großteil des Genoms zu nicht-proteinkodierenden beziehungsweise nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs) umgeschrieben wird. Lange, nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) im Bereich von 200 nt bis >100 kb stellen eine große Untergruppe von ncRNAs dar. Sie sind nicht nur wichtige Akteure in verschiedenen physiologischen und entwicklungsbezogenen Prozessen, sondern auch Regulatoren verschiedener Krebsarten, wie Leberkrebs. Der globale Krebsstatistikbericht von 2018 hat gezeigt, dass Leberkrebs die vierthäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit, sowie die sechsthäufigste diagnostizierte Krebsart ist. Zudem weist Leberkrebs im fortgeschrittenen Stadium eine sehr niedrige Gesamtüberlebensrate von weniger als 20 % auf. Dies rechtfertigt weitere Untersuchungen zum Verständnis der molekularen Mechanismen, welche die Hepatokarzinogenese antreiben. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse tragen zur Entdeckung verbesserter Diagnose- Prognose- und Behandlungsmethoden bei. In der vorliegenden Arbeit habe ich eine Transkriptomprofilierung von lncRNAs in Leberkrebs durchgeführt und eine neue lncRNA identifiziert, die ich lincNMR (long intergenic non-coding RNA-Nucleotide Metabolism Regulator) genannt habe. LincNMR lag im hepatozellulären Karzinom im Vergleich zu normalem Lebergewebe sechsfach induziert vor. Die Depletion von lincNMR verursachte einen starken Proliferationsdefekt in diversen Leberkrebszelllinien und führte zu einer Induktion der Seneszenz. Dieser Phänotyp wurde auch in mehreren Brust- und Lungenkrebszelllinien beobachtet, was auf eine krebsweite Rolle von lincNMR hindeutet. Die Stilllegung von lincNMR führte zu einer starken Abnahme der wichtigsten dNTP-synthetisierenden Enzyme RRM2, TK1 und TYMS. Dies impliziert eine Regulation des Nukleotidstoffwechsels durch lincNMR. Insbesondere waren die dNTP-Spiegel in Leberkrebszellen nach dem Verlust von lincNMR signifikant gesenkt. Hervorzuheben ist, dass der durch die Runterregulierung von lincNMR induzierte Proliferationsdefekt durch Zugabe von extrazellulären dNTPs zu den Zellen aufgehoben werden konnte. Eine Kombination aus in vivo RNA Antisense Aufreinigung und Massenspektrometrie (RAP-MS) identifizierte YBX1 als direkten Interaktionspartner von lincNMR. Zudem zeige ich, dass YBX1 die Genexpression von RRM2, TK1 und TYMS reguliert. Dass wiederum lincNMR die Transaktivierungsaktivität von YBX1 steuert, erwies die Durchführung eines Luciferase-Assays. Schließlich untersuchte ich die Relevanz von lincNMR für das Tumorwachstum in vivo mittels eines Hühnerei-Chorion-Allantoic-Membran (CAM)-Tests. Größe und Gewicht von lincNMR-depletierten Tumoren waren im Vergleich zu nicht-depletierten Tumoren signifikant reduziert. Zusammenfassend habe ich eine neuartige lncRNA, lincNMR, entdeckt, welche die Proliferation von Tumorzellen über die nukleotidstoffwechselsteuernde YBX1-RRM2-TK1-TYMS-Achse reguliert.