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Molecular downstream mechanisms of the oncogenic transcriptional regulators YAP/TAZ in hepatocarcinogenesis

Knaub, Maria

German Title: Molekulare Nachfolge-Mechanismen der onkogenen transkriptionellen Regulatoren YAP/TAZ in der Hepatokarzinogenese

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Abstract

Cancer is worldwide the leading cause of death in the 21st century. Liver cancer represents the fourth most common cancer with hepatocellular carcinoma (HCC) being the most frequent primary liver cancer. HCC is the second most common cause of cancer-related deaths with a 5-year survival rate below 12% in the US. These sobering numbers illustrate the need for bio-medical research to identify novel target structures and to develop respective therapeutic strategies. The evolutionarily conserved Hippo signaling pathway is frequently deregulated in human hepatocarcinogenesis. Indeed, overexpression of the transcriptional co-activators yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ) is associated with pro-proliferative and anti-apoptotic effects in liver tumor cells. However, among the identified direct YAP/TAZ target genes, no functional groups or protein families have been described, which facilitate the biological properties of YAP and TAZ in HCC cells. Since these groups may represent relevant molecular hubs that mediate the tumor-supporting properties of the Hippo pathway, this study aimed to define YAP/TAZ-regulated protein families, which may represent promising therapeutic target structures. Based on comprehensive transcriptome analysis after siRNA-mediated inhibition of YAP and TAZ in HCC cells, the minichromosome maintenance (MCM) protein family, which is crucial for DNA replication, and members of the polycomb repressive complex 2 (PRC2), which inserts epigenetic repression marks (trimethylation of histone H3; H3K27me3), were identified as YAP and/or TAZ target genes. For the MCM family members (MCM2-7), different molecular approaches confirmed the direct transcriptional regulation via YAP/TAZ and the transcription factor TEA domain transcription factor 4 (TEAD4) in independent liver cancer lines. In contrast, the PRC2 components Enhancer Of Zeste 2 (EZH2) and Suppressor Of Zeste 12 Protein Homolog (SUZ12) were predominantly regulated by YAP and TEAD4. Functionally, RNAi-mediated MCM reduction as well as YAP and TAZ perturbations decreased cell proliferation in vitro. Additionally, YAP induces the expression of PRC2 components and their epigenetic mark H3K27me3 in vitro, leading to the repression of target gene transcription. In a YAP-dependent HCC mouse model (inducible expression of constitutively active YAPS127A)) a clear positive association between YAP overexpression and especially abundance of MCM family members confirmed the in vitro results. Statistical correlations between tumor progression, YAP expression and MCM2-7, EZH2, and SUZ12 abundance in primary patient tissues supported the hypothesis that both protein groups are cooperatively induced by YAP and TEAD4 in human HCC. Together, these results illustrate that the Hippo pathway contributes to tumor progression via the regulation of protein groups that induce biological functions. The transcriptional regulation of MCM helicase by the Hippo pathway introduces a promising surrogate marker for YAP driven proliferation. Furthermore, YAP induced transcription of PRC2 members illustrates a new possibility of YAP mediated gene silencing and offers a novel approach to understand oncogenic Hippo/YAP feedback loops. Interestingly, both YAP and TAZ are important for the regulation of all MCM family members, while data for PRC2 constituents point to a predominant role of YAP. This differential dependency of target genes might represent a molecular mechanism of how the Hippo pathway regulates specific biological processes, as epigenetic changes and replication. This is of special importance since direct perturbation of the Hippo/YAP/TAZ-axis could also inhibit pro-regenerative properties (e.g. proliferation), which might be of relevance for patients with chronically damaged livers. Thus, targeting these important downstream hubs could represent one strategy to selectively impair YAP and/or TAZ-dependent HCC cell functionality while saving physiological hepatocellular proliferation in regenerative livers, which could maintain residual liver function. Still, further studies are needed to test if MCM proteins and PRC2 are suitable points-of-interference in HCC patients with YAP and/or TAZ activation.

Translation of abstract (German)

Weltweit sind Krebserkrankungen die häufigste Todesursache im 21. Jahrhundert. Die vierthäufigste Krebsart ist Leberkrebs, wobei das Hepatozelluläre Karzinom (hepatocellular carcinoma; HCC) der häufigste primäre Leberkrebs ist. Außerdem ist das HCC weltweit die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von unter 12 % in den USA. Diese ernüchternden Zahlen verdeutlichen die Notwendigkeit neue therapeutische Strategien zu entwickeln. Hierzu müssen zunächst relevante Zielstrukturen identifiziert werden. In der humanen Hepatokarzinogenese liegt der evolutionär konservierte Hippo-Signalweg häufig dereguliert vor, wobei die Überexpression der transkriptionellen Co-Aktivatoren yes-associated protein (YAP) und Transcriptional Co-Activator With PDZ-Binding Motif (TAZ) mit pro-proliferativen und anti-apoptotischen Effekten in Lebertumorzellen einhergehen. Bisher wurden keine funktionellen Gruppen oder Proteinfamilien unter den identifizierten direkten Zielgenen beschrieben, die die biologischen Eigenschaften von YAP und TAZ in HCC-Zellen vermitteln. Da diese Gruppen relevante molekulare Knotenpunkte bei der Vermittlung tumorunterstützenden Eigenschaften des Hippo-Signalwegs darstellen können, war es das Ziel dieser Studie vielversprechende therapeutische Zielstrukturen unter den YAP/TAZ-regulierten Proteinfamilien zu definieren. Basierend auf einer umfassenden Transkriptomanalyse, nach siRNA-vermittelter Reduktion von YAP und TAZ in HCC-Zellen, wurden zwei Proteinfamilien als YAP- und/oder TAZ-Zielgene identifiziert. Der für die DNA-Replikation relevante minichromosome maintenance (MCM)- Komplex wurde durch YAP, TAZ und den Transkriptionsfaktor TEA Domain Transkriptionsfaktor 4 (TEAD4) transkriptionell reguliert, was durch verschiedene molekularbiologische Methoden in unabhängigen HCC-Zelllinien bestätigt wurde. Weiterhin wurden die Mitglieder des polycomb repressive complex 2 (PRC2), der epigenetische Repressionsmarkierungen (Trimethylierung des Histons H3; H3K27me3) einfügt, überwiegend durch YAP und TEAD4 reguliert Funktionell führte die RNAi-vermittelte MCM-Reduktion, sowie die YAP- und TAZ-Reduktion, zu einer verringerten Zellproliferation in vitro. Darüber hinaus induziert YAP die Expression der PRC2-induzierten epigenetischen Markierung H3K27me3 in vitro und unterdrückt so potentiell die Transkription der Zielgene. In einem YAP-abhängigen HCC-Mausmodell (induzierbare Expression von konstitutiv aktivem YAPS127A) bestätigte sich eine klare Assoziation zwischen YAP-Überexpression und vor allem einer erhöhten Konzentration an MCM-Familienmitgliedern. Statistische Korrelationen zwischen dem Tumorwachstum, der YAP-Expression und der Überexpression von MCM2-7 und den PRC2 Komponenten Enhancer Of Zeste 2 (EZH2) und Suppressor Of Zeste 12 Protein Homolog (SUZ12) unterstützten die Hypothese, dass beide Proteingruppen im humanen HCC durch YAP induziert werden. Gemeinsam zeigen diese Ergebnisse, dass der Hippo-Signalweg durch die Regulation ganzer Proteinfamilien zur Tumorprogression beiträgt. Die transkriptionelle Regulation der MCM-Helikase durch den Hippo-Signalweg stellt einen vielversprechenden Marker für die YAP-abhängige Proliferation dar. Darüber hinaus ist die YAP-induzierte Transkription von PRC2-Komponenten ein neuer Modus der YAP-vermittelten Genrepression und bietet einen Ansatz zur Untersuchung potentieller onkogener Hippo/YAP-Feedback-Mechanismen. Interessanterweise sind sowohl YAP als auch TAZ für die Regulierung aller MCM-Familienmitglieder wichtig, während Daten für die PRC2-Komponenten auf eine dominante Rolle von YAP hinweisen. Diese unterschiedliche Abhängigkeit von Zielgenen könnte einen molekularen Mechanismus des Hippo-Signalwegs darstellen um spezifische biologische Eigenschaften in verschiedenen Zellphasen zu regulieren. Dieses Wissen ist von besonderer Bedeutung, da eine direkte Perturbation der Hippo/YAP/TAZ-Signalachse auch regenerative Eigenschaften beeinflusst, welche essentiell für Patienten mit chronisch geschädigten Lebern sein können. Somit könnte die Fokussierung auf diese wichtigen nachgelagerten Knotenpunkte eine mögliche Strategie darstellen, um selektiv die YAP- und/oder TAZ-abhängige onkogene HCC-Zellfunktionalität zu beeinträchtigen und gleichzeitig die physiologische hepatozelluläre Proliferation in regenerativen Lebern zu erhalten. Dennoch sind weitere Studien erforderlich, um zu testen, ob MCM-Proteine und PRC2 geeignete therapeutische Angriffspunkte bei HCC-Patienten mit YAP- und/oder TAZ-Aktivierung sind.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bartenschlager, Prof. Dr. Ralf
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 11 September 2019
Date Deposited: 02 Oct 2019 06:37
Date: 2019
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Medizinische Fakultät Heidelberg > Pathologisches Institut
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
610 Medical sciences Medicine
Controlled Keywords: Signaltransduktion, Leberkrebs, Proliferation
Uncontrolled Keywords: Hippo; YAP; TAZ; hepatocarcinogenesis; MCM; PRC2; EZH2; Leber; HCC
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