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Elucidating astrocyte and neuron interactions using genetically encoded fluorescent indicators

Sonntag, Hannah

[img] PDF, English
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Abstract

Astrocytes are organized in what can be regarded as parallel networks to local neuronal networks. On the cellular level astrocytes immediately react to stimulated neuronal activity by transient increases in intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) which results in vitro in a vesicular release of so-called gliotransmitters such as ATP, D-serine and glutamate. In turn these gliotransmitters directly modulate synaptic transmission. Those synapses are regarded as tri-partite connections composed of the pre- and post-synapse enveloped by astrocyte processes. Several mouse models suggested astrocytes as key entities to tune synaptic transmission to vigilance states of synchronized neuronal activity oscillations. However, due to conflicting findings it is still under debate whether gliotransmission takes place under physiological conditions and, in particular, whether and how the activity of a single astrocyte or the general astrocyte population is an indicator for altered coordinated activity of a neural network. In the presented study the bidirectional communication of astrocytes and neurons was investigated. First, by a glia-neuron tracing approach in vivo and second by the simultaneous recording of neuronal and astrocytic activity during pharmacologically-induced oscillatory activity of cultured hippocampal slices. The tracing approach demonstrated in multiple independent experiments, that the rAAV-delivered retrograde tetanus toxin heavy chain tracer (eGFP-TTC) in hippocampal neurons is transferred to retrogradely connected neurons but is not translocated to, or between astrocytes. This excludes the existence of the neuron-like presynaptic target structures in astrocytes, exploited by eGFP-TTC. Likewise, eGFP-TTC is not transferred from astrocytes to neurons. Thus, the eGFP-TTC experiments cannot be used for tracing of neurons in putative networks build of tripartite synapses and moreover do not support the gliotransmission hypothesis. For the population analysis during neuronal oscillations, astrocyte [Ca2+]i and neuronal [Ca2+]i transients were recorded simultaneously by neuron- and astroglia-transduced Ca2+ indicators jRGeco and GCaMP6f, respectively. In both cell types the frequency and the kinetics of [Ca2+]i transient were not affected by the pharmacologically induced oscillations. Temporal cross-correlation analysis of the activity failed to identify any correlations in astrocytes and neuronal [Ca2+]i signals and could not identify any preferred [Ca2+]i transient sequence patterns. From these observations it can be concluded, that in the pharmacologically induced oscillation model either the [Ca2+]i transients in both cell populations are independent from the conditions and from each other, or that the applied virus delivered activity indicators combined with epifluorescence imaging are insufficient to allow detection of subtle correlations in these cells.

Translation of abstract (German)

Astrozyten sind in parallelen Netzwerken zu lokalen neuronalen Netzwerken organisiert und es wurde wiederholt nachgewiesen, dass einzelne Astrozyten in vitro direkt auf stimulierte neuronale Aktivität mit transienten Anstiegen der intrazellulären Kalziumkonzentration [Ca2+]i reagieren. Diese Transienten führen zu einer vesikulären Freisetzung von Transmittern wie z.Bsp. ATP, D-Serin oder auch Glutamat durch die Astrozyten, die sog. Gliotransmission. Diese Transmitter beeinflussen direkt die neuronale synaptische Signalübertragung, weshalb man seit einigen Jahren bestimmte Synapsen als drei-, statt zwei-teilige Struktur versteht. Der dritte Teil wird hierbei von Astrozytenausläufern gebildet und umhüllt die Prä- und Postsynapse. In vivo Mausmodelle suggerieren, dass die Astozytenaktivität synchronisierte Oszillationen in der neuronalen Aktivität wesentlich beeinflussen. Es ist jedoch nach wie vor ist umstritten, ob Gliotransmission unter physiologischen Bedingungen stattfindet und insbesondere, ob und wie Veränderungen in der Aktivität von neuronalen Netzwerken durch die Aktivität einzelner Astrozyten oder der Gesamtheit der Astrozytenpopulation gemessen werden kann. In der vorliegenden Studie wurde die bidirektionale Kommunikation zwischen Astrozyten und Neuronen im Detail zum einen mit einem Glia-Neuron-Tracing-Ansatz in vivo und zum anderen mit simultanen Aktivitätsmessungen von Neuronen und Astrozyten während pharmakologisch induzierter neuronaler Oszillationen in Gehirnschnittkulturen, untersucht. Im Tracing-Ansatz konnte eindeutig gezeigt werden, dass der von rAAV gelieferte retrograde Tracer (eGFP-TTC), welcher auf Tetanustoxin basiert, von hippocampalen Neuronen retrograd auf synaptisch verbundene Neurone übertragen wird, dabei jedoch nicht auf Astrozyten. Daher kann geschlussfolgert werden, dass die von eGFP-TTC benötigten Neuronen-ähnlichen präsynaptischen Strukturen nicht bei Astrozyten existieren. Weiterhin bedeutet das Ergebnis, dass das präsentierte Tracing-system nicht für die Kartierung von neuronalen Netzwerken, welche sich drei-teilige Synapsen mit Astrozyten teilen, genutzt werden kann. Für die Aktivitätsmessungen wurden gleichzeitig [Ca2+]i -Transienten von Astrozyten und Neuronen mit den zellspezifisch transduzierten Ca2+-Indikatoren jRGeco bzw. GcaMP6f gemessen. In beiden Zelltypen wurden die Frequenz und die Kinetik der [Ca2+]i transienten durch Gamma-Oszillationen nicht beeinflusst. Auch Kreuzkorrelationsanalysen von Astrozyten- und Neuronenaktivität konnten keine zeitlichen Zusammenhänge oder bevorzugte [Ca2+]i -Sequenzmuster identifizieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass das in dem pharmakologisch induzierten Oszillationsmodel entweder die Astrozyten- oder die Neuronenaktivität unabhängig voneinander und von den Oszillation sind, oder dass die angewandten Methoden, wie z.B. die viral transduzierten Kalziumindikatoren oder die Verwendung von Epifloureszenzmikroskopie, nicht ausreichen um subtile Muster in der Aktivität dieser Zellen zu detektieren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Draguhn, Prof. Dr. Andreas
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 27 September 2019
Date Deposited: 14 Oct 2019 09:58
Date: 2019
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut fuer Physiologie und Pathophysiologie
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
Controlled Keywords: Nervenzelle, Astrozyt, Glia
Uncontrolled Keywords: Astrozyten Neurone Interaktion, Calcium imaging, fluorescent indicators
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