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The Role of the Mucin-Like Glycoprotein Podoplanin in the Progression of Cutaneous Squamous Cell Carcinoma

Schwab, Melanie

[img] PDF, English
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Abstract

The incidence of cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) is increasing each year. Although early stages of cSCC can still be treated successfully, late stage tumors invade into the surrounding tissue and metastasize to distant body sites, which is associated with a poor prognosis. Strong upregulation of the transmembrane glycoprotein Podoplanin (PDPN) has been demonstrated in various tumor entities including cSCC. Enhanced PDPN expression was correlated to poor cSCC patients’ outcome, but its function in skin cancer progression is still unknown. Therefore, my study aimed to define the impact of PDPN on cSCC carcinogenesis. The descriptive analysis of differentiated cSCC patients’ material showed PDPN overexpression in tumor cells and increased expression in activated fibroblasts, particularly at the invasive front of the tumor. To functionally examine the importance of PDPN in cSCC tumor cells, PDPN was deleted in human and murine cSCC cell lines by the CRISPR/Cas9 technology followed by functional in vitro assays. Human and murine cells harboring a PDPN knockout (KO) genotype showed similar morphology and proliferative behavior as control cells in monolayer culture system. Performing both the Boyden Chamber assay and the most advanced three-dimensional organoid skin cancer model demonstrated that the loss of PDPN in human cells neither affected transmigration nor invasion. Strikingly, murine Pdpn KO cells transmigrated and invaded with less efficiency in both approaches. The invasive phenotype of murine tumor cells was further characterized to be independent of epithelial-mesenchymal transition (EMT). An initial examination of one previously described PDPN downstream pathway revealed that ezrin recruitment and cytoskeletal remodeling were not impaired upon Pdpn KO in 2D culture. Complementing these in vitro approaches, labeled murine control and Pdpn KO cells were injected orthotopically into the dermis of nude mice, to define the role of PDPN in tumor progression in vivo. Formed tumors derived from control and Pdpn KO cells displayed a well-differentiated morphology with a PDPN-positive reaction in fibroblasts in the tumor stroma recapitulating human cSCC. Smaller tumors as well as delayed tumor outgrowth were observed upon Pdpn loss, which was due to reduced tumor cell proliferation in vivo. Moreover, abrogation of Pdpn resulted in diminished EMT-independent tumor cell invasion. In conclusion, this study underscores the crucial impact of PDPN in cSCC progression. Future studies are required in order to characterize underlying molecular mechanisms that could propose potential therapeutic strategies targeting PDPN-dependent tumor cell invasion especially in late-stage cSCC patients.

Translation of abstract (German)

Die Inzidenz des kutanen Plattenepithelkarzinoms (cSCC) nimmt jährlich zu. Obwohl frühe Stadien des cSCCs noch erfolgreich behandelt werden können, wachsen fortgeschrittene Tumore invasiv in das umliegende Gewebe ein und metastasieren zu entfernten Organen, was mit einer schlechten Prognose verbunden ist. Eine starke Hochregulierung des transmembranen Glykoproteins Podoplanin (PDPN) wurde in verschiedenen Krebsarten,einschließlich cSCC, gezeigt. Die erhöhte PDPN Expression korreliert mit einem schlechten Krankheitsausgang für cSCC Patienten. Allerdings ist seine Funktion in der cSCC Entwicklung noch immer unbekannt. Deshalb zielte meine Studie darauf ab, den Einfluss von PDPN in der cSCC Karzinogenese zu bestimmen. Die deskriptive Analyse von differenziertem cSCC Patientenmaterial zeigte eine PDPN Überexpression in Tumorzellen und in aktivierten Fibroblasten, insbesondere an der invasiven Tumorfront. Um die Bedeutung von PDPN in cSCC Krebszellen zu untersuchen, wurde PDPN mithilfe der CRISPR/Cas9-Technologie in humanen und murinen cSCC Zelllinien deletiert und anschließend diese Zellen in vitro funktionell analysiert. Humane und murine Zellen, die einen PDPN knockout (KO) Genotyp tragen, zeigten eine ähnliche Morphologie sowie ein ähnliches Wachstumsverhalten wie die Kontrollzellen im Einzelzellschicht-Kultursystem. Die Durchführung des Boyden-Kammer-Experiments und des drei-dimensionalen organoiden Hautkrebsmodells zeigten, dass der Verlust von PDPN in humanen Zellen weder die Transmigration noch die Invasion beeinträchtigte. Murine Pdpn KO Zellen hingegen transmigrierten und wuchsen weniger invasiv in beiden Ansätzen. Der invasive Phänotyp der murinen Tumorzellen war unabhängig von einer epithelial-mesenchymalen Transition (EMT). Eine erste Untersuchung einer bereits beschriebenen PDPN nachfolgenden Signaltransduktion zeigte, dass die Rekrutierung von Ezrin und die Modulation des Zytoskeletts nicht durch den Pdpn KO in der 2D Kultur beeinflusst waren. Zur Vervollständigung dieser in vitro Experimente, wurden markierte murine Kontroll- und Pdpn KO-Zellen orthotop in die Dermis von Nacktmäusen injiziert, um die Rolle von PDPN in der Tumorentwicklung in vivo zu definieren. Gewachsene Tumore, die von Kontroll- oder Pdpn KO-Zellen stammten, wiesen eine gut differenzierte Morphologie auf; darüber hinaus zeigten Fibroblasten im Tumorstroma eine PDPN-positive Reaktion, was insgesamt humane cSCCs rekapituliert. Durch den Verlust von Pdpn traten kleinere Tumore sowie verzögertes Tumorwachstum auf. Beide Beobachtungen waren auf ein vermindertes Krebszellwachstum in vivo zurückzuführen. Des Weiteren führte das Fehlen von Pdpn zu einer verringerter EMT-unabhängigen Tumorzellinvasion. Zusammenfassend unterstreicht diese Studie die entscheidende Bedeutung von PDPN in der cSCC Entwicklung. Zukünftige Untersuchungen sind erforderlich, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu charakterisieren und um mögliche therapeutische Strategien zu empfehlen, die auf die PDPN-abhängige Krebszellinvasion insbesondere in Patienten mit späten cSCC Stadien zielen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Angel, Prof. Dr. Peter
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 7 November 2019
Date Deposited: 09 Dec 2019 13:47
Date: 2019
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
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