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Structural studies of influenza A virus by cryo-electron tomography

Peukes, Julia

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Abstract

Influenza A virus (IAV) is a pleomorphic, enveloped virus known for its yearly epidemics and occasional, but fatal pandemics. The outer surface glycoprotein hemagglutinin (HA) together with the matrix protein 1 (M1) are the most abundant protein components of assembled virions. HA, located at the outside of virions, is involved in cell receptor recognition, membrane fusion and is the most relevant protein for antibody binding. Therefore the structure of isolated HA has been extensively characterised by X-ray crystallography. However, it remains unclear to which extent the structure of isolated HA corresponds to the in situ HA structure on the surface of IAV. M1 determines the morphology of the virus by forming a matrix layer underneath the viral membrane. A high resolution structure of full length M1 is missing and the lack of information about the in situ arrangement of the M1 matrix layer currently limits our understanding of how M1 functions. Here, I set out to determine the structures of HA and M1 directly from IAV particles using high resolution cryo-electron tomography (cryoET) and subtomogram averaging. I found that virus purification can affect the integrity of the virus HA glycoprotein layer and the morphology of virus particles. I therefore adapted a workflow which allows studying the structure of viral proteins directly from viruses in the vicinity of virus-producing cells. Biosafety regulations required inactivation of IAV samples by chemical fixation prior to cryoEM imaging. To assess effects of fixation, I complemented structural studies of HA from pathogenic, fixed IAV particles with studies of HA from non-infectious, unfixed virus-like particles (VLPs). These studies revealed that fixation captures HA in an open conformation while HA structures determined from unfixed samples perfectly match the closed conformation observed in the trimeric crystal structure. In concordance with recent work by others, this observation suggests that fixation captures HA in a an open, otherwise transient conformation, which is part of a constant opening and closing motion known as breathing motion. To characterise the in situ structure and arrangement of M1, I established a subtomogram averaging workflow to cope with the challenges presented by the small size of M1. I successfully obtained two independent structures of M1 directly from viruses and VLPs. Comparisons of my structures to existing high resolution models of the N-terminal domain (NTD) of M1 revealed that M1 monomers arrange as parallel strands, with a helical propensity and directly underneath the membrane. For the first time, my data allow to describe the M1-membrane interface as well as relevant M1-M1 interfaces within the matrix layer. Finally, I have gained first structural insights into the M1 C-terminal domain (CTD). I further combined the obtained structural information for M1 with a theoretical model of the mechanics of M1 polymerization and membrane deformation during virus assembly. The obtained results suggest that linear polymerization of M1 into multiple parallel strands efficiently provides energy to drive assembly of new virus particles. The results presented in this thesis improve our understanding of the arrangement and structure of the two influenza proteins HA and M1 in situ which has implications for current models of HA-mediated membrane fusion, virus architecture and virus assembly.

Translation of abstract (German)

Influenza A Virus (IAV) ist ein pleomorphes, behuelltes Virus, das für das Ausbrechen jährlicher Epidemien und seltener Pandemien verantwortlich ist. Das Glykoprotein Hemagglutinin (HA) und das Matrix Protein 1 (M1) machen den groessten Bestandteil des Virusteilchens aus. Das Oberflächen- protein HA erkennt zelluläre Rezeptoren und ist essenziell für die Membranfusion zwischen der Endosomenmembran der Wirtszelle und der Virusmembran. Da HA das wichtigste Protein für die Antikörperbildung ist, wurde die Struktur mehrfach mit Hilfe der Kristallstrukturanalyse bestimmt. Dennoch bleibt unverstanden, ob die Struktur des isolierten HA Proteins der Struktur des HA Proteins auf der Virenoberfläche entspricht. M1 formt eine Matrix unter der viralen Membrane und beeinflusst die Morphologie der Virusteilchen. Die Struktur des M1 Proteins ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Die fehlende Charakterisierung der Struktur sowie der M1 Anordnung innerhalb des Virusteilchens erschwert es, ein besseres Verständnis der Funktionen des Proteins zu erlangen. In dieser Arbeit habe ich mit Hilfe der Kryoelektronentomographie in Kombination mit einer Datenauswertung durch „Subtomogram Averaging“ die in situ Strukturen der Proteine HA und M1 direkt aus den Virusteilchen bestimmt. Ich beobachtete, dass die Aufreinigung der Virusteilchen zu Artefakten auf der Virusoberfläche und zu einer Veränderung der Virusmorphologie führen kann. Daher habe ich eine Methode optimiert, die ohne die Aufreinigung der Virusteilchen auskommt. Auf Grund der geltenden Sicherheitsbestimmungen mussten IAV Proben vor dem Mikroskopieren durch eine chemische Fixierung mit Formaldehyd deaktiviert werden. Um mögliche Effekte der Fixierung auf die Probe und die Struktur des HA Proteins zu evaluieren, habe ich zusätzliche Proben mit nicht infektiösen Virus-ähnlichen Partikeln (VLP) ohne Inaktivierung präpariert. Ein direkter Vergleich der erhaltenden HA Strukturen hat gezeigt, dass die Fixierung eine offene Konformation des HA Proteins stabilisiert, während die HA Struktur nicht fixierter VLPs der geschlossenen Konformation existierender Kristallstrukturen gleicht. Die offenere HA Konformation wurde kürzlich auch von anderen beobachtet und die gezeigten Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass sich HA auf der Virenoberflaeche kontinuierlich öffnet und schliesst, was auch als "Atmen" des Proteins bezeichnet wird. Für eine strukturelle in situ Charakterisierung des M1 Proteins wurden die Parameter des Subto- mogram Averaging Ablaufes speziell auf die geringe Proteingröße von M1 angepasst. So habe ich sowohl eine Struktur des M1 Proteins aus Viren als auch aus VLPs bestimmen können. Ein Vergleich der in situ M1 Struktur mit höher aufgelösten Proteinkristallstrukturen der M1 N-terminalen Domäne (NTD) ergab, dass sich im Virus mehrere M1 Monomere in parallelen Strängen mit helikalem Verlauf an der Innenseite der Membran anordnen. Dank der in situ Struktur kann ich zum ersten Mal die Schnittstelle zwischen M1 und der viralen Membran sowie die bisher unbekannte Struktur der M1 C-terminalen Domäne charakterisieren. Diese strukturellen Studien wurde mit einem theoretischen Model kombiniert, das die Bildung neuer Virusteilchen und die Polymerisation des M1 Proteins in Verbindung setzt. Der Vergleich des Models mit experimentellen Daten ergab, dass die lineare M1 Polymerisation ausreichend Energie zur Bildung neuer Viren freisetzt. Zusammenfassend tragen die vorgestellten Ergebnisse betreffend der Anordnung und der in situ Strukturen der Influenzavirenproteine HA und M1 zu einem besseren Verständnis der HA induzierten Membranfusion, der Virusteilchenarchitektur und der Virenassemblierung bei.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Briggs, Dr. John
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 6 November 2019
Date Deposited: 08 Jan 2020 14:38
Date: 2020
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
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