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Structural insights into regulation of gene expression

Macošek, Jakub

German Title: Strukturelle Einsichten in die Regulation der Genexpression

[img] PDF, English
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Abstract

The thesis comprises two parts investigating structural aspects of various mechanisms of translational control. The first chapter investigates a mechanism behind ribosome stalling alleviation. Poly-proline stretches often induce ribosome stalling, which needs to be alleviated to translate the mRNA. In bacteria the ribosomes are rescued by Elongation Factor P (EF-P). EF-P is activated by diverse post-translational modifications (PTMs) of a positively charged amino acid. Such PTM is the glycosylation of arginine conserved in approximately 10% of all bacterial species including severe pathogens (e.g. Pseudomonas aeruginosa). The arginine is glycosylated by a glycosyltransferase EarP which attaches rhamnose to the arginine. Impairing the glycosylation reduces the pathogenicity of the bacteria. However, EarP is an uncharacterized glycosyltranferase as it is only the first documented case of arginine N-glycosylation in prokaryotes. Hence, the mechanism of EF-P rhamnosylation by EarP was investigated using nuclear magnetic resonance spectroscopy, X-ray crystallography and various in vivo and in vitro assays. The atomic structure of EarP with its substrate dTDP-rhamnose was solved and the in vivo and in vitro assays together with subsequent studies elucidate the putative mechanism of EarP rhamnosylation thus providing basis for targeted antibiotic drug design. The second chapter investigates the translational suppression of the hunchback (hb) mRNA. The hb mRNA forms during Drosophila development a protein gradient governing the anterior-posterior body axis formation. The Hunchback protein gradient results from the suppression of hb mRNA at posterior by a complex of three proteins – Pumilio (Pum), Nanos and Brain tumor (Brat). Nanos, expressed in an opposing gradient to Hunchback, provides spatial information. Uniformly expressed Pum and Brat are RNA binding proteins that specifically recognize the hb mRNA. The structure of Brat bound to the hb mRNA, and the structure the complex of Pum and Nanos bound to the hb mRNA have been previously solved. However, it remains unclear how exactly these three proteins assemble on the hb mRNA together, and if they are structurally and functional directly linked. The complex was investigated using modelling based on small-angle X-ray and neutron scattering data combined with additional restraints from cross-linking/mass spectrometry. The data were further complemented and validated by various in vitro assays such as electrophoretic mobility shift assays and isothermal titration calorimetry. The investigation provides initial insights about the complex and paves the way for future approaches to fully elucidate the structure of the complex.

Translation of abstract (German)

Diese Arbeit besteht aus zwei Teilen, in denen strukturelle Aspekte verschiedener Mechanismen der Translationskontrolle untersucht werden. Das erste Kapitel untersucht den Mechanismus zur Aufhebung der Blockade von Ribosomen (Ribosom stalling). Polyprolin-Abfolgen führen häufig zur Blockade des Ribosoms, die aufgehoben werden muss, um die mRNA translatieren zu können. In Bakterien erfolgt dies durch den Elongationsfaktor P (Elongation factor P (EF-P). EF-P wird durch verschiedene posttranslationale Modifikationen (PTMs) einer positiv geladenen Aminosäure aktiviert. Eine solche PTM ist die Argininglycosylierung, die in etwa 10 % all Bakterienarten, darunter einigen gefährlichen Pathogenen (z.B. Pseudomonas aeruginosa) konserviert ist. Arginin wird dabei durch die Glycosyltransferase EarP mit Rhamnose verbunden. Beeinträchtigung der Glycosylierung vermindert die Pathognität der Bakterien. EarP ist jedoch bislang kaum charakterisiert, da es der erste dokumentierte Fall von N-Glycosylierung eines Arginins in Prokaryoten ist. Daher wurde der Mechanismus der EF-P rhamnosylierung durch EarP mit Hilfe von Kernspinresonanzspektroskopie, Röntgenstrukturanalyse und verschiedene biochemische Experimente in vivo und in vitro untersucht. Die Struktur von EarP mit seinem Substrat dTDPRhamnose wurde bestimmt und beleuchtet zusammen mit den in-vivo und invitro Experimenten den wahrscheinlichen Mechanismus der EarP Rhamnosylation. Dies legt die Basis für die gezielte Entwicklung neuer Antibiotika. Das zweite Kapitel behandelt die Hemmung der Translation der hunchbackmRNA (hb). Die hb mRNA bildet während der Embryonalentwicklung der Fruchtfliege Drosophila einen Proteingradienten aus, der zur Ausbildung der Anterior-Posterior-Achse führt. Dieser Gradient entsteht durch die Unterdrückung der mRNA durch einen Komplex aus drei Proteinen – Pumilio (Pum), Nanos and Brain tumor (Brat). Die Expression von Nanos in einem Gradienten mit entgegengesetzter Orientierung zum Hunchback-Gradienten definiert hierbei die räumliche Orientierung. Die Expression der RNA-bindenden Proteine Pum und Brat, die die hb-mRNAspezifisch erkennen, ist hingegen gleichförmig. Sowohl die Struktur des an die hb mRNA gebundenen Brats als auch des Pum/Nanos/hbmRNA- Komplexes ist bekannt. Es ist jedoch bislang unklar, wie diese drei Proteine zusammen auf der RNA angeordnet sind und ob sie strukturell und funktional direkt verbunden sind. Ein Modell des Komplexes wurde anhand von Daten aus Röntgen- und Neutronenkleinwinkelstreuungsexperimente und Abstandsinformationen aus der Massenspektrometrie des quervernetzten Komplexes (Crosslinking mass spectrometry) erstellt. Diese Daten wurden vervollständigt und bestätigt durch verschiedene in vitro assays, wie z.B. Affinitätselektrophorese oder Isotherme Titrationskalorimetrie. Die Untersuchungen geben erste Einblicke in die Struktur des Komplexes und ebnen den Weg für zukünftige Versuche zur vollständigen Aufklärung der Struktur des Komplexes.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hennig, Dr. Janosch
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 22 November 2019
Date Deposited: 08 Jan 2020 14:09
Date: 2020
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: structural biology, translation suppression, ribosome stalling, drosophila development
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