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STED Nanoscopy to Illuminate New Avenues in Cancer Research – From Live Cell Staining and Direct Imaging to Decisive Preclinical Insights for Diagnosis and Therapy

Matthias, Jessica

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Abstract

Molecular imaging is established as an indispensable tool in various areas of cancer research, ranging from basic cancer biology and preclinical research to clinical trials and medical practice. In particular, the field of fluorescence imaging has experienced exceptional progress during the last three decades with the development of various in vivo technologies. Within this field, fluorescence microscopy is primarily of experimental use since it is especially qualified for addressing the fundamental questions of molecular oncology. As stimulated emission depletion (STED) nanoscopy combines the highest spatial and temporal resolutions with live specimen compatibility, it is best-suited for real-time investigations of the differences in the molecular machineries of malignant and normal cells to eventually translate the acquired knowledge into increased diagnostic and therapeutic efficacy. This thesis presents the application of STED nanoscopy to two acute topics in cancer research of direct or indirect clinical interest. The first project has investigated the structure of telomeres, the ends of the linear eukaryotic chromosomes, in intact human cells at the nanoscale. To protect genome integrity, a telomere can mask the chromosome end by folding back and sequestering its single-stranded 3’-overhang in an upstream part of the double-stranded DNA repeat region. The formed t-loop structure has so far only been visualized by electron microscopy and fluorescence nanoscopy with cross-linked mammalian telomeric DNA after disruption of cell nuclei and spreading. For the first time, this work demonstrates the existence of t-loops within their endogenous nuclear environment in intact human cells. The identification of further telomere conformations has laid the groundwork for distinguishing cancerous cells that use different telomere maintenance mechanisms based on their individual telomere populations by a combined STED nanoscopy and deep learning approach. The population difference was essentially attributed to the promyelocytic leukemia (PML) protein that significantly perturbs the organization of a subpopulation of telomeres towards an open conformation in cancer cells that employ a telomerase-independent, alternative telomere lengthening mechanism. Elucidating the nanoscale topology of telomeres and associated proteins within the nucleus has provided new insight into telomere structure-function relationships relevant for understanding the deregulation of telomere maintenance in cancer cells. After understanding the molecular foundations, this newly gained knowledge can be exploited to develop novel or refined diagnostic and treatment strategies. The second project has characterized the intracellular distribution of recently developed prostate cancer tracers. These novel prostate-specific membrane antigen (PSMA) inhibitors have revolutionized the treatment regimen of prostate cancer by enabling targeted imaging and therapy approaches. However, the exact internalization mechanism and the subcellular fate of these tracers have remained elusive. By combining STED nanoscopy with a newly developed non-standard live cell staining protocol, this work confirmed cell surface clustering of the targeted membrane antigen upon PSMA inhibitor binding, subsequent clathrin-dependent endocytosis and endosomal trafficking of the antigen-inhibitor complex. PSMA inhibitors accumulate in prostate cancer cells at clinically relevant time points, but strikingly and in contrast to the targeted antigen itself, they eventually distribute homogenously in the cytosol. This project has revealed the subcellular fate of PSMA/PSMA inhibitor complexes for the first time and provides crucial knowledge for the future application of these tracers including the development of new strategies in the field of prostate cancer diagnostics and therapeutics. Relying on the photostability and biocompatibility of the applied fluorophores, the performance of live cell STED nanoscopy in the field of cancer research is boosted by the development of improved fluorophores. The third project in this thesis introduces a biocompatible, small molecule near-infrared dye suitable for live cell STED imaging. By the application of a halogen dance rearrangement, a dihalogenated fluorinatable pyridinyl rhodamine could be synthesized at high yield. The option of subsequent radiolabeling combined with excellent optical properties and a non-toxic profile renders this dye an appropriate candidate for medical and bioimaging applications. Providing an intrinsic and highly specific mitochondrial targeting ability, the radiolabeled analogue is suggested as a vehicle for multimodal (positron emission tomography and optical imaging) medical imaging of mitochondria for cancer diagnosis and therapeutic approaches in patients and biopsy tissue. The absence of cytotoxicity is not only a crucial prerequisite for clinically used fluorophores. To guarantee the generation of meaningful data mirroring biological reality, the absence of cytotoxicity is likewise a decisive property of dyes applied in live cell STED nanoscopy. The fourth project in this thesis proposes a universal approach for cytotoxicity testing based on characterizing the influence of the compound of interest on the proliferation behavior of human cell lines using digital holographic cytometry. By applying this approach to recently developed live cell STED compatible dyes, pronounced cytotoxic effects could be excluded. Looking more closely, some of the tested dyes slightly altered cell proliferation, so this project provides guidance on the right choice of dye for the least invasive live cell STED experiments. Ultimately, live cell STED data should be exploited to extract as much biological information as possible. However, some information might be partially hidden by image degradation due the dynamics of living samples and the deliberate choice of rather conservative imaging parameters in order to preserve sample viability. The fifth project in this thesis presents a novel image restoration method in a Bayesian framework that simultaneously performs deconvolution, denoising as well as super-resolution, to restore images suffering from noise with mixed Poisson-Gaussian statistics. Established deconvolution or denoising methods that consider only one type of noise generally do not perform well on images degraded significantly by mixed noise. The newly introduced method was validated with live cell STED telomere data proving that the method can compete with state-of-the-art approaches. Taken together, this thesis demonstrates the value of an integrated approach for STED nanoscopy imaging studies. A coordinated workflow including sample preparation, image acquisition and data analysis provided a reliable platform for deriving meaningful conclusions for current questions in the field of cancer research. Moreover, this thesis emphasizes the strength of iteratively adapting the individual components in the operational chain and it particularly points towards those components that, if further improved, optimize the significance of the final results rendering live cell STED nanoscopy even more powerful.

Translation of abstract (German)

Die molekulare Bildgebung hat sich als unverzichtbares Instrument zahlreicher Felder der onkologischen Forschung etabliert und erfährt insbesondere Anwendung in der Grundlagenforschung, in der präklinischen Forschung, in klinischen Studien sowie in der Diagnostik und Therapie. In den letzten drei Jahrzehnten wurden im Speziellen auf dem Gebiet der Fluoreszenzbildgebung mit der Entwicklung verschiedener In-vivo-Varianten außergewöhnliche Fortschritte gemacht. Als Teilgebiet ist die Fluoreszenzmikroskopie in erster Linie ein experimentelles Mittel, welches einen direkten Zugang zu den zentralen Fragestellungen der molekularen Onkologie eröffnet. Die Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie bietet herausragende räumliche und zeitliche Auflösung bei gleichzeitiger Eignung für die Bildgebung lebender Proben. Folglich erlaubt sie die Echtzeituntersuchung von Unterschieden in der molekularen Maschinerie entarteter und gesunder Zellen und generiert hierbei Wissen, welches schließlich in einer verbesserten diagnostischen und therapeutischen Wirksamkeit mündet. Diese Dissertation präsentiert die Anwendung der STED-Nanoskopie auf zwei hochaktuelle wissenschaftliche Thematiken der Krebsforschung von direktem sowie indirektem klinischen Interesse. Das erste Projekt widmete sich der Strukturcharakterisierung von Telomeren in intakten menschlichen Zellen auf molekularer Ebene. Telomere, die Enden der linearen eukaryotischen Chromosomen, dienen dem Schutz der Genomintegrität. Sie können das jeweilige Chromosomenende maskieren, indem sie eine schleifenartige Struktur ausbilden, welche durch den Einschub des einzelsträngigen 3'-Überhangs in einen stromaufwärts gelegenen Abschnitt der doppelsträngigen repetitiven Telomere-DNA Sequenz stabilisiert wird. Bisher untersucht wurde diese T-Loop-Struktur ausschließlich mittels Elektronenmikroskopie und optischer Nanoskopie anhand von Telomer-DNA, die aus Säugetierzellkernen isoliert, chemisch quervernetzt und auf einer Oberfläche präpariert wurde. Die vorliegende Arbeit dokumentiert zum ersten Mal die Existenz von T-Loops in endogenem Kontext in intakten menschlichen Zellen. Die Identifizierung weiterer Telomerkonformationen lieferte die Grundlage für die Unterscheidung von Krebszellen, die verschiedene Telomererhaltungsmechanismen verwenden. Ein kombinierter Ansatz aus STED-Nanoskopie und Tiefenlernen (Deep Learning) konnte charakteristische Gegensätze in den individuellen Telomerpopulationen quantifizieren. Diese Gegensätze wurden im Wesentlichen auf das Promyelozytenleukämie (PML) Protein zurückgeführt, welches eine offenere DNA-Konformation für eine Subpopulation von Telomeren in Krebszellen begünstigt, die einen Telomerase-unabhängigen, alternativen Telomerverlängerungsmechanismus verwenden. Die Aufklärung der molekularen Topologie von Telomeren und assoziierten Proteinen im Zellkern ermöglichte neue Einblicke in die Struktur-Funktions-Zusammenhänge von Telomeren, die für das Verständnis der Deregulierung der Telomererhaltung in Krebszellen relevant sind. Nachdem die molekularen Grundlagen verstanden wurden, kann das neu gewonnene Wissen zur Entwicklung neuartiger sowie verfeinerter Diagnose- und Behandlungsansätze eingesetzt werden. In diesem Sinne beschäftigte sich das zweite Projekt mit der Charakterisierung der intrazellulären Verteilung kürzlich entwickelter Prostatakrebs-Tracer. Diese neuartigen Inhibitoren des Prostata-spezifischen Membranantigens (PSMA) haben die Behandlung des Prostatakarzinoms revolutioniert, indem sie zielgerichtete Ansätze für bildgebende Diagnostik und Therapie ermöglichen. Der genaue Internalisierungsmechanismus sowie der subzelluläre Verbleib dieser Tracer sind bisher allerdings noch nicht bekannt gewesen. Die Kombination von STED-Nanoskopie mit einem in dieser Arbeit neu entwickelten atypischen Protokoll zur Anfärbung lebender Zellen konnte bestätigen, dass PSMA-Inhibitoren die Aggregation (Clustering) des gebundenen Membranantigens induzieren und dass der Antigen-Inhibitor-Komplex nach anschließender Clathrin-abhängiger Endozytose den endosomalen Transportweg durchläuft. PSMA-Inhibitoren reichern sich innerhalb des klinisch relevanten Zeitrahmens in Prostatakrebszellen an und zeigen bemerkenswerterweise, im Gegensatz zum Membranantigen, final eine homogene zytosolische Verteilung. Dieses Projekt hat erstmalig den subzellulären Verbleib von PSMA/PSMA-Inhibitor-Komplexen aufgeklärt und liefert entscheidende Erkenntnisse für die zukünftige Anwendung der untersuchten Tracer, einschließlich der Entwicklung neuer Strategien auf dem Gebiet der Diagnostik und Therapie von Prostatakrebs. Die Leistungsfähigkeit der Lebendzell-STED-Bildgebung in der onkologischen Forschung hängt maßgeblich von der Photostabilität und Biokompatibilität der verwendeten Fluorophore ab und wird daher durch die Entwicklung verbesserter Fluorophore weiter gesteigert. Das dritte Projekt dieser Dissertation stellt einen nicht-toxischen, niedermolekularen Nah-Infrarot-Farbstoff vor, welcher für die STED-Bildgebung lebender Zellen geeignet ist. Durch Anwendung einer Halogentanz-Umlagerung konnte ein dihalogeniertes, fluorierbares Pyridinylrhodamin mit hoher Ausbeute synthetisiert werden. Die optionale Radiomarkierung, hervorragende optische Eigenschaften sowie die Biokompatibilität qualifizieren diesen Farbstoff für die medizinische und biologische Bildgebung. Aufgrund seiner intrinsischen, hochspezifischen Affinität zu Mitochondrien, kann das radiomarkierte Analogon voraussichtlich in der multimodalen medizinischen Bildgebung (Positronen-Emissions-Tomographie und optische Bildgebung) von Mitochondrien in Krebspatienten sowie in der Pathologie für diagnostische und therapeutische Ansätze eingesetzt werden. Die Abwesenheit von Zytotoxizität ist nicht nur für klinisch angewandte Fluorophore eine unerlässliche Voraussetzung. Sie ist ebenfalls eine entscheidende Eigenschaft von Farbstoffen, die in der Lebendzell-STED-Bildgebung eingesetzt werden. Je weniger diese Farbstoffe das biologische System stören, umso getreuer spiegeln die Daten die biologische Realität wider. Das vierte Projekt dieser Dissertation schlägt einen universellen Ansatz für einen Zytotoxizitätstest vor, der mittels digitaler holographischer Zytometrie den Einfluss der zu untersuchenden Verbindung auf das Proliferationsverhalten menschlicher Zelllinien charakterisiert. Durch diesen Ansatz konnten für kürzlich entwickelte lebendzell-STED-kompatible Farbstoffe ausgeprägte zytotoxische Effekte ausgeschlossen werden. Da einige der getesteten Farbstoffe die Zellproliferation leicht beeinflussten, bieten die vorliegenden Ergebnisse eine Unterstützung bei der geeigneten Farbstoffwahl, um minimal-invasive Lebendzell-STED-Experimente zu gewährleisten. Im finalen Schritt der Datenanalyse sollten aus Lebendzell-STED-Daten so viele biologische Informationen wie möglich extrahiert werden. Die gezielte Wahl konservativer Bildgebungsparameter zum Schutz der Lebensfähigkeit der Proben sowie deren Dynamik führen zu Kompromissen in der Bildqualität. Hierdurch können gewisse biologische Informationen teilweise verborgen bleiben. In dem fünften Projekt dieser Dissertation wird eine neuartige Bildwiederherstellungsmethode (image restoration) mit einem Bayes‘schen Ansatz vorgestellt, die gleichzeitig Entfaltung, Rauschentfernung sowie Auflösungssteigerung (super-resolution) erlaubt und Bilder mit gemischter Poisson-Gauß'scher Rauschstatistik wiederherstellt. Etablierte Entfaltungs- sowie Entrauschungsverfahren, die nur eine Art von Rauschen berücksichtigen, führen bei Bildern, die durch signifikantes Mischrauschen beeinträchtigt werden, in der Regel nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen. Dass die neu eingeführte Methode mit aktuellen Bildverarbeitungsansätzen konkurrieren kann, wurde mittels Anwendung auf Lebendzell-STED-Telomerdaten nachgewiesen. Zusammenfassend demonstriert diese Dissertation den Stellenwert eines integrierten Ansatzes für STED-nanoskopische Studien. Eine koordinierte Vorgehensweise von der Probenvorbereitung über die Bildaufnahme bis zur Datenanalyse lieferte eine zuverlässige Grundlage, auf der in aktuellen Fragen der onkologischen Forschung aussagekräftige Rückschlüsse gezogen werden konnten. Diese Arbeit unterstreicht die Bedeutung einer iterativen Anpassung der einzelnen Schritte und motiviert gezielte Verbesserungsansätze, um die Signifikanz der Endergebnisse zu optimieren und die Leistungsfähigkeit von Lebendzell-STED-Bildgebung weiter zu steigern.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Dr. Joachim
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 6 December 2019
Date Deposited: 08 Jan 2020 09:59
Date: 2020
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
570 Life sciences
610 Medical sciences Medicine
Controlled Keywords: STED Nanoscopy, Cancer Research
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